時間：2023-05-30 09:04:10
開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創(chuàng)造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇細胞核的功能，希望這些內(nèi)容能成為您創(chuàng)作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進步。
[關(guān)鍵詞] 細胞核的功能細胞核的結(jié)構(gòu)
一、導入新課
創(chuàng)設(shè)情景：播放視頻草履蟲的生殖、應激性、變形蟲的取食運動和人體白細胞吞噬病菌的過程。
師：同學們想一想：他們在進行生命活動的時候，究竟是細胞中的哪部分結(jié)構(gòu)起著決定性的作用呢？通過前面的學習，我們知道細胞作為生命系統(tǒng)中最小的結(jié)構(gòu)層次，其內(nèi)部每時每刻都在進行著各種精確而有序的生物化學反應，這又是受誰的控制呢？（停頓片刻），這就是我們今天要學習的，系統(tǒng)的控制中心：細胞核（板書）
二、講授新課
師：細胞核在細胞的生命活動是如何起作用？為了研究這個問題，科學家們做了很多實驗，今天我們就沿著科學家走過的足跡，去看看他們是如何進行科學探究的。（屏幕顯示：科學探究的基本步驟，教師簡單解說）
師：（黑白美西螈圖片）美西螈是一種兩棲類動物，根據(jù)膚色可分為美西螈和白美西螈兩種，于是科學家們提出這樣一個問題：美西螈的膚色是由細胞核還是細胞質(zhì)控制的呢？
生：是細胞核控制的。
師：這個假設(shè)是否正確還需用實驗來證明，下面我們看科學家是如何證明的，請同學讀教材52頁資料1。
生：學生朗讀。（幻燈片展示美西螈核移植圖解）
師：（教師解釋核移植技術(shù)）根據(jù)這個實驗能否充分證明假設(shè)是正確呢？
生：不能。
師：如何再設(shè)計實驗使實驗結(jié)果更具有說服力呢？
（學生小組討論）
生：將白美西螈胚胎細胞的核取出，移植到黑美西螈的去核的卵細胞中，看植入核的卵細胞發(fā)育成的美西螈的膚色。
師：通過兩組實驗的對比，使實驗更加的嚴密，這樣可以得出結(jié)論：美西螈的膚色是由細胞核控制的。
師：（幻燈展示傘藻圖片）傘藻是單細胞的綠藻，分為帽、柄和假根，其中細胞核位于假根部位，根據(jù)帽形可分為傘形帽和形帽，傘藻再生性很強，即帽切除之后，很短時間內(nèi)能夠生出新的帽，是什么決定了帽的形態(tài)呢？如何設(shè)計一個實驗證實自己的假設(shè)呢？
（學生小組討論）
生：將兩種傘藻帽切除并且去掉核，再分別植入另外一種的細胞核，看看他們分別再生出哪種形態(tài)的帽。
師：（幻燈放映傘藻核移植圖解）你很有發(fā)展成科學家的潛質(zhì)，非常好。這樣就可以說明細胞核決定了傘藻帽的形態(tài)建成，但是科學家們當時并沒有直接想到利用核移植來驗證，而是先做了兩種傘藻嫁接的實驗（展示實驗過程圖解），同學們分析一下，這個實驗能否證明就是細胞核決定了傘藻帽的形態(tài)呢？為什么？
（學生小組討論）
生：不能，因為假根部分還有部分細胞質(zhì)存在，所以不能排除細胞質(zhì)的影響。
師：回答得非常精彩，（掌聲鼓勵），同學們還記得初中學過的科學家們利用類似的核移植方法誕生的動物明星――多莉嗎？（幻燈顯示：克隆羊多莉誕生的過程圖解）下面有哪位同學能結(jié)合圖解，描述一下多莉的誕生過程？
生：學生回答，教師適當補充。
師：非常棒！小多莉雖然是由C羊生出來的，但多莉長得像誰？為什么？
生：像 B 羊，因為多莉的細胞核來自 B 羊。
師：結(jié)合前面的資料分析和多莉的產(chǎn)生過程，我們能看出生物體的性狀遺傳主要是由細胞核決定的。這與細胞核中的什么物質(zhì)有關(guān)呢？
生：DNA，DNA 是遺傳信息的載體，主要分布在細胞核中。
師：因此可以說，細胞核是遺傳信息庫。（板書：一、功能：遺傳信息庫）
師：以上的資料說明細胞核與細胞的遺傳有關(guān)，那細胞核與細胞的代謝活動是否關(guān)系呢？我們看資料2。
生：讀教材52頁資料2。
師：（屏幕展示過程圖解）結(jié)合圖解能得出什么結(jié)論？
生：細胞核與細胞的分裂、分化有關(guān)系。
師：細胞核還與細胞其他的生命活動有關(guān)系嗎？科學家用變形蟲做了一個這樣的實驗。
生：認真閱讀教材53頁資料3。（學生邊讀，教師邊播放圖解）
師：既然無核部分即將死亡，有核部分能正常生活，為什么科學家還要將有核一半中的核鉤出來，然后再移植回去，這樣做的目的是什么呢？
（學生小組討論）
生：這樣做可以使實驗更加嚴密，因為細胞質(zhì)內(nèi)有大量的細胞器，很可能通過切割使兩部分的細胞器分布不均，造成了無核的部分沒有細胞器也就不能再繼續(xù)生存下去。
生：細胞質(zhì)中也有少量的 DNA 和 RNA 在一定程度上也能影響生物體的生命活動。
師：回答的太棒了，那人的成熟紅細胞還能生長分裂嗎？為什么？
生：不能，因為沒有細胞核。
師：綜合這些資料，找同學概括一下，細胞核具有什么功能？
生：細胞核是細胞遺傳和代謝的控制中心。（板書）
師：我們知道結(jié)構(gòu)決定功能（板書），細胞核有如此重要的功能，它的結(jié)構(gòu)又是怎樣的呢？給同學們3分鐘時間閱讀課本53頁細胞核的結(jié)構(gòu)并完成學案（細胞核結(jié)構(gòu)表格略）。
師：接下來給同學們5分鐘時間，認真閱讀54頁第一自然段，看一下作為遺傳信息載體的染色質(zhì)和染色體有什么區(qū)別和聯(lián)系，并完成學案（染色體與染色質(zhì)比較的表格）。
縱觀各地高考卷不難發(fā)現(xiàn)，本考點多次考查，命題多圍繞細胞核的結(jié)構(gòu)與功能進行，尤其是核膜、核孔、核仁，在最后復習階段需予以重視.一、考點掃描考點一：細胞核的結(jié)構(gòu)1.細胞核的有無（個數(shù)）對于真核生物來說，絕大多數(shù)細胞具有一個核.凡是無核細胞，既不能生長也不能分裂，如哺乳動物和人的成熟紅細胞、血小板、植物的篩管細胞；人工去核的細胞，一般不能存活太久.也有的生物細胞具有兩個或是多個核，例如雙小核草履蟲；人的骨骼肌細胞中細胞核多達數(shù)百個.對于原核生物，由于其沒有核膜包被的細胞核，故稱作擬核.2.細胞核的結(jié)構(gòu)（1）染色質(zhì)與染色體的關(guān)系同種物質(zhì)（DNA與蛋白質(zhì)組成）在不同時期的兩種形態(tài)（分裂間期染色質(zhì)，分裂期染色體），如同鋼絲與彈簧.染色質(zhì)分裂前期：螺旋變粗分裂末期：解螺旋，變細變長染色體（2）核膜雙層膜，外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連，且有核糖體附著；在有絲分裂中周期性地消失和重建；具有選擇透過性（如無機小分子、有機小分子包括ATP、離子）.核膜是不連續(xù)的，上面分布有核孔.（3）核孔核孔并不是一個簡單的孔洞，而是一個相對獨立鑲嵌著由多種不同的蛋白質(zhì)構(gòu)成的復雜結(jié)構(gòu)――核孔復合體，實現(xiàn)核質(zhì)之間頻繁的物質(zhì)交換和信息交流.一些大分子物質(zhì)依據(jù)自身的擬定位信號和與核孔中專一受體蛋白（載體）結(jié)合而實現(xiàn)主動運輸.如細胞質(zhì)合成的DNA和RNA所需的聚合酶以及染色體中的組蛋白和核糖體蛋白都要通過核孔運入核內(nèi)，核內(nèi)生成的各種RNA以及組裝好的核糖體亞基等大分子又必須通過核孔運出.但是它控制物質(zhì)的通過不光依靠孔徑的大小，還依靠核膜，核孔周圍的各種蛋白質(zhì)，即使是直徑小于核孔的物質(zhì)，也不一定能順利通過，所以仍然具有選擇性.（4）核仁折光性強，將碘液滴加到新鮮洋蔥鱗莖表皮細胞，可見細胞核被染成紅褐色，而核仁染得更深，易與其他結(jié)構(gòu)區(qū)分；在有絲分裂中周期性地消失和重現(xiàn)，參與rRNA的合成及核糖體的形成 .（5）核孔的數(shù)量、核仁的大小與細胞代謝有關(guān)，如代謝旺盛、蛋白質(zhì)合成量大的細胞，核孔數(shù)多，核仁較大，如兩棲類的卵母細胞，核孔數(shù)可達百萬.核孔的作用是實現(xiàn)核質(zhì)之間頻繁的物質(zhì)交換和信息交流，因此代謝旺盛的細胞核孔數(shù)目較多.考點二：細胞核的功能遺傳信息庫，遺傳和代謝的控制中心，但不是細胞代謝的中心（細胞代謝的主要場所是細胞質(zhì)基質(zhì)）.二、例題解析例1（2014宿遷調(diào)研改編）如圖1為細胞核結(jié)構(gòu)模式圖，下列有關(guān)敘述正確的是（）.A.①主要由DNA和蛋白質(zhì)組成，在細胞分裂不同時期形態(tài)相同B.破壞②不會影響胰島素的合成C.核膜由兩層磷脂分子構(gòu)成，在細胞分裂中發(fā)生周期性變化D.蛋白質(zhì)和RNA等生物大分子穿過核孔進出細胞核需要能量解析選D.解答本題的關(guān)鍵是： （1）正確識別圖中的①為染色質(zhì)，②為核仁. （2）明確核孔具有選擇透過性.圖中①為染色質(zhì)，由絲狀DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，在細胞分裂不同時期形態(tài)不同；②為核仁，其功能是與rRNA的合成和核糖體的形成有關(guān)，若破壞核仁，則核糖體無法形成，不能合成胰島素；核膜是雙層膜，即四層磷脂分子構(gòu)成；蛋白質(zhì)和RNA等大分子物質(zhì)通過核孔完成細胞質(zhì)與細胞核之間的物質(zhì)交換，需要能量.例2（2009山東高考）真核細胞單位面積的核孔數(shù)目與細胞類型和代謝水平有關(guān).以下細胞中核孔數(shù)目最少的是（）.A.胰島細胞
B.造血干細胞C.效應B細胞（漿細胞）
D.口腔上皮細胞解析選D.細胞的代謝越旺盛，則核孔的數(shù)目越多.A、C中的細胞分別分泌胰島素（或胰高血糖素）和抗體，代謝旺盛.B中細胞的分裂能力很強，代謝旺盛.只有D為高度分化的細胞，代謝較弱.故而D中的口腔上皮細胞的核孔數(shù)目最少. 例3（2014安徽聯(lián)考）如圖2為某種生物的細胞核及相關(guān)結(jié)構(gòu)示意圖，有關(guān)敘述正確的是（
）.圖2A.核孔是大分子物質(zhì)進出細胞核的通道，不具有選擇性B.圖示中有中心體，說明該生物為低等植物或動物 C.在衰老的細胞中，細胞核體積減小，染色質(zhì)濃縮 D.rRNA（核糖體RNA）和蛋白質(zhì)在核仁中合成并組裝成核糖體解析選B.核孔也具有選擇透過性，不允許核內(nèi)DNA外出；中心體存在低等植物細胞或動物細胞中；在衰老的細胞中，由于代謝緩慢，細胞核代償性增大，染色質(zhì)濃縮；蛋白質(zhì)合成的場所是核糖體.例4（2014南通調(diào)研改編）下列關(guān)于細胞核的敘述正確的是（
）.A.真核細胞的核膜上有大量的多種酶，有利于多種化學反應的順利進行B.在顯微鏡下觀察分裂間期的真核細胞，可以看到細胞核的主要結(jié)構(gòu)有核膜、核仁和染色體C.葉肉細胞利用核孔實現(xiàn)核內(nèi)外DNA，RNA和蛋白質(zhì)的交換D.原核細胞的擬核除沒有核膜外，其他方面與真核細胞的細胞核沒有差別 解析選A.核膜為酶提供了大量的附著位點，有利于多種生化反應的順利進行.真核細胞分裂間期的核中無染色體，有絲狀染色質(zhì)；DNA分子不能通過核孔，而RNA及某些蛋白質(zhì)分子可以通過；原核細胞的擬核不僅無核膜，而且它只是一個的大型環(huán)狀DNA分子，沒有與蛋白質(zhì)結(jié)合成染色體，也無核仁等結(jié)構(gòu).（收稿日期：2015-06-13）
細胞學知識是生物學的核心基礎(chǔ)知識，在高中教材中占有舉足輕重的地位。其中，多種多樣的細胞、細胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能、主要細胞器的結(jié)構(gòu)與功能、細胞核的結(jié)構(gòu)與功能、細胞的有絲分裂、細胞的分化、細胞的全能性、細胞的衰老和凋亡與人體健康的關(guān)系在考綱中屬于Ⅱ類要求，即理解所列知識和其他相關(guān)知識之間的聯(lián)系與區(qū)別，并能在較復雜情景中綜合應用其進行分析、判斷、推理和評價。
分析2013年各地高考試題發(fā)現(xiàn)：細胞學知識大多通過結(jié)構(gòu)圖、模式圖、坐標圖等形式，并與細胞代謝綜合起來進行考查，如江蘇卷第29題將細胞器、細胞膜和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運相結(jié)合進行考查（例4）；江蘇卷第3題和浙江卷第1題側(cè)重考查了有絲分裂的相關(guān)知識；山東卷第2題考查了細胞分化的知識；江蘇卷第7題綜合考查了分化、衰老、凋亡與癌變的相關(guān)知識。另外從題型上看，這方面的知識涉及的考查點多，內(nèi)容比較淺顯，所以大多以選擇題形式出現(xiàn)，如新課標全國卷I第3題，山東卷第1題，天津卷第1題，安徽卷第1題，北京卷第1題，浙江卷第2題等。
二、2013年典型高考試題的剖析
例1 （2013?安徽卷）生物膜將真核細胞分隔成不同的區(qū)室，使得細胞內(nèi)能夠同時進行多種化學反應，而不會相互干擾。下列敘述正確的是（ ）
A.細胞核是mRNA合成和加工的場所
B.高爾基體是肽鏈合成和加工的場所
C.線粒體將葡萄糖氧化分解成CO2和H2O
D.溶酶體合成和分泌多種酸性水解酶
【解析】細胞核是轉(zhuǎn)錄的場所，所以是mRNA合成和加工的場所，A正確。核糖體是肽鏈的合成場所，B錯誤。葡萄糖是不能進入線粒體的，C錯誤。溶酶體中的酶是在核糖體上合成的，并經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體加工和修飾后分泌的，D錯誤。
【答案】A。
〖點評〗此題題干是課文原話，可見課本知識是必須要牢牢掌握的。這四個選項是細胞核功能和幾種細胞器功能的組合，難度不大，體現(xiàn)了對基礎(chǔ)知識的考查。盡管課文沒有涉及細胞核是mRNA加工的場所，但只要同學們對蛋白質(zhì)的合成場所、呼吸作用的過程知識熟練，通過排除法是可以準確作答的。
例2 （2013?天津卷）下列過程未體現(xiàn)生物膜信息傳遞功能的是（ ）
A.蔗糖溶液使洋蔥表皮細胞發(fā)生質(zhì)壁分離
B.抗原刺激引發(fā)記憶細胞增殖分化
C.胰島素調(diào)節(jié)靶細胞對葡萄糖的攝取
D.傳出神經(jīng)細胞興奮引起肌肉收縮
【解析】當外界蔗糖溶液濃度較高時，洋蔥表皮細胞滲透失水發(fā)生質(zhì)壁分離，該過程不涉及信息傳遞；記憶細胞與抗原具有特異性識別作用，該過程與細胞膜上的糖蛋白有關(guān)，糖蛋白具有信息識別功能；靶細胞膜表面的受體能與胰島素結(jié)合，從而使胰島素發(fā)揮作用；傳出神經(jīng)細胞興奮引起肌肉收縮的過程中有神經(jīng)遞質(zhì)與細胞膜上相應受體的結(jié)合。B，C，D項均體現(xiàn)了生物膜的信息傳遞功能。
【答案】A。
〖點評〗此題難度中等偏上。考查學生對生物膜信息傳遞概念的理解，只有徹底理解這部分內(nèi)容，才能準確評判生物學過程或生物學現(xiàn)象。對此概念課文沒有過多的文字闡述，而是列舉了具體事例并用彩圖直觀告知。在教學時需要老師高度概括提煉這一概念的要素和要點。確認是否為信息傳遞，需有三個基本要素：信號分子、靶細胞受體、靶細胞內(nèi)發(fā)生復雜的生物效應。①信號分子具有傳遞信息的作用：胰島素、神經(jīng)遞質(zhì)與靶細胞受體結(jié)合后，引起靶細胞內(nèi)發(fā)生一系列復雜的反應，說明二者屬于信號分子，能夠傳遞某種信息；而抗原表面的特異性蛋白等物質(zhì)（免疫學上稱之為表面抗原或抗原決定簇）也相當于信號分子，刺激記憶細胞后，引發(fā)了記憶細胞增殖分化。②靶細胞上有和信號分子結(jié)合的受體。③靶細胞上的受體與信號分子特異性結(jié)合后，必須發(fā)生一系列復雜的生物效應，如生化反應水平提高、膜電位變化等，才能說明體現(xiàn)了信息傳遞功能。
例3 （2013?山東卷）將小鼠myoD基因?qū)塍w外培養(yǎng)的未分化肌肉前體細胞，細胞分化及肌纖維形成過程如圖所示。下列敘述正確的是（ ）
A.攜帶myoD基因的載體以協(xié)助擴散的方式進入肌肉前體細胞
B.檢測圖中細胞核糖體蛋白基因是否表達可確定細胞分化與否
C.完成分化的肌肉細胞通過有絲分裂增加細胞數(shù)量形成肌纖維
D.肌肉前體細胞比肌肉細胞在受到電離輻射時更容易發(fā)生癌變
【解析】攜帶myoD基因的載體為環(huán)狀DNA分子，該大分子物質(zhì)不會以協(xié)助擴散的方式進入細胞，在基因工程中用顯微注射法，A錯誤。核糖體蛋白基因控制合成核糖體蛋白，該基因在每個活細胞中均會表達，B錯誤。完成分化的肌肉細胞已失去了分裂能力，不再進行細胞分裂，C錯誤。由題意可知，肌肉前體細胞屬于未分化細胞，處于分裂狀態(tài)，DNA復制時受電離輻射的影響程度遠大于已不再分裂的肌肉細胞，因此更容易發(fā)生癌變，D正確。
【答案】D。
〖點評〗此題考查了學生對細胞的分裂、分化和癌變等知識理解和應用能力。在細胞分化的過程中控制基本生命活動的有關(guān)蛋白質(zhì)基因是活細胞，它均可以表達，而有些基因是選擇性表達的，因此細胞之間有了穩(wěn)定性的差異――細胞分化，所以只有檢測肌肉細胞特有的蛋白質(zhì)才能確定細胞分化與否。B選項對學生有一定的難度。題圖告訴我們肌肉細胞是由肌肉前體細胞分裂分化而來，解題時不能忽視這一題圖信息，平時要注意識圖、析圖能力訓練。
例4 （2013?江蘇卷）如圖為某細胞的部分結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運示意圖，請回答下列問題：
（1）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的蛋白質(zhì)不能穿過 進入細胞核，表明這種轉(zhuǎn)運具有 性。
（2）細胞膜選擇透過性的分子基礎(chǔ)是 具有疏水性和 具有專一性。
（3）若該細胞是高等植物的葉肉細胞，則圖中未繪制的細胞器有 。
（4）若該細胞為小鼠骨髓造血干細胞，則圖示細胞處于細胞周期的 ，此時在光學顯微鏡下觀察明顯可見細胞核中有 存在。
（5）研究表明硒對線粒體膜有穩(wěn)定作用，可以推測人體缺硒時下列細胞中最易受損的是 （填序號）。
①脂肪細胞 ②淋巴細胞 ③心肌細胞 ④口腔上皮細胞
【解析】（1）由圖可知附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上合成的蛋白質(zhì)，沒有箭頭指向細胞核，而是經(jīng)高爾基體加工后有三個去向：成為細胞膜的成分之一、分泌到細胞外、變?yōu)槿苊阁w內(nèi)的酶。不能進入細胞核，而細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)進入細胞核的通道是核孔。
（2）細胞膜上磷脂分子的尾部是脂肪酸，具有疏水性。細胞膜上的轉(zhuǎn)運蛋白具有特定的空間結(jié)構(gòu)，能與被轉(zhuǎn)運的物質(zhì)特異性結(jié)合，體現(xiàn)了膜對物質(zhì)運輸?shù)倪x擇性。
（3）高等植物的葉肉細胞內(nèi)含有葉綠體，并且成熟的植物細胞具有大液泡。
（4）核膜在前期消失，在末期重現(xiàn)，圖中可見完整的細胞核，說明該細胞處于細胞周期的間期。在細胞核中只有染色質(zhì)和核仁，明顯可見的只能是核仁了，即使圖上看不到，也必須填寫“核仁”。
（5）細胞內(nèi)線粒體參與細胞有氧呼吸，缺硒線粒體膜無法穩(wěn)定，進而影響到細胞內(nèi)能量的產(chǎn)生，而題目提供的細胞中，心肌細胞對能量的要求最高，所以最易受損。
【答案】（1）核孔 選擇 （2）磷脂雙分子層 膜轉(zhuǎn)運蛋白 （3）葉綠體和液泡 （4）分裂間期 核仁 （5）③
〖點評〗此題考查了學生識圖、析圖的能力和準確規(guī)范表達能力。首先從圖中確認細胞器及蛋白質(zhì)的種類，理解圖中箭頭所示的含義是解答本題的關(guān)鍵。題圖展示了游離核糖體合成的蛋白質(zhì)和附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體合成的蛋白質(zhì)的不同去向。
要做到規(guī)范答題有效得分，應根據(jù)所填空格前后的語境和語意仔細推敲來確定內(nèi)容，再組織語言，例如第（4）小題中關(guān)鍵詞“明顯可見”就確定了該空的答案。平時的復習需注意以下幾點：①熟記乃至背誦教材語言。②套用一些平時作答時常用句式如“在一定的范圍內(nèi)”“等量且適量”“分組編號”“觀察記錄”等。③善于使用題干語言，有些空就是來自題干中的某一詞或短語，作答時不宜更改或遺漏，與題干語言保持高度一致。
三、2014年高考復習策略及命題趨勢預測
（一）復習策略
1.抓住教材，熟練掌握基礎(chǔ)知識
知識是能力的載體，一定量的知識儲備及良好的知識結(jié)構(gòu)是各種能力形成和提高的必備條件。在本專題基礎(chǔ)知識復習時可用圖形、表格等形式，通過比較、辨析來加強理解記憶有關(guān)概念、過程、原理。如（1）真核細胞與原核細胞的比較；（2）植物細胞與動物細胞的比較；（3）葉綠體與線粒體的比較；（4）染色體、染色質(zhì)和染色單體的比較；（5）有絲分裂與減數(shù)分裂的比較；（6）載體與運載體的比較；（7）原生質(zhì)體與原生質(zhì)層的比較；（8）糖蛋白、脂蛋白、球蛋白和分泌蛋白的比較；（9）細胞膜的信息傳遞功能與物質(zhì)交換功能的比較；（10）細胞分裂與細胞分化的比較；（11）細胞衰老、凋亡和壞死的比較；（12）主動運輸與被動運輸?shù)谋容^；（13）斐林試劑與雙縮脲試劑的比較。通過對以上相關(guān)、相似、易混的概念進行比較，加強記憶，鞏固基礎(chǔ)知識。
2.精選巧練，提高解題能力
從每年的高考試題中選擇有代表性的題目進行練習，由淺入深，由易到難，由基礎(chǔ)知識到分析推理，形成一個循序漸進的訓練過程，培養(yǎng)和提高解題能力。
審題能力：仔細審題，這是正確解答試題的前提。一些選擇題題干中包含的關(guān)鍵詞語，如“正確”與“錯誤”，“一對”與“一個”，“主要”與“次要”，“根本原因”與“直接原因”，“一定”“可能”“唯一”等。找準這些關(guān)鍵詞語，對正確解題起到至關(guān)重要的作用。對于非選擇題，在看題、讀題、解題和答題過程中，同樣要看準關(guān)鍵詞，理解題意，然后正確作答。尤其是實驗題，審準題目的性質(zhì)和目的至關(guān)重要。
理解能力：在理解能力方面比較突出的問題是，對有關(guān)知識理解不透，掌握得不夠牢固，因此，對題干所提供的信息材料不能正確理解，不懂得出題人的用意，不能準確地進行知識的遷移。如何提高理解能力呢？應注意三個方面：①夯實課本上的基礎(chǔ)知識。②提高閱讀理解能力，通常在解題時要養(yǎng)成良好習慣，快速泛讀一遍，再細讀一遍，將關(guān)鍵字詞注上標記。③理解出題人的用意。
表達能力：在高考試題中的非選擇題部分，重點體現(xiàn)《考試大綱》對考生表達能力的要求。如“能用文字、圖表以及數(shù)學方式等多種表達形式準確地描述生物學方面的內(nèi)容”。學生在這一部分失分較多，主要原因有：①表達時，用詞隨意，不能用生物學術(shù)語準確地描述。②在對生物現(xiàn)象解釋時，組織的語言與之不構(gòu)成因果關(guān)系。③在實驗方法步驟的陳述中思路混亂，表達不清，語言拖泥帶水，不能做到言簡意賅。在做非選擇題時，全面、準確地表達生物信息是得分的重要保障。在平時的訓練中要模仿課文的表達模式及用詞的嚴密性和完整性。
3.重視基本實驗，提高分析能力
這部分的實驗較多，有觀察類實驗（如觀察多種多樣的細胞、線粒體和葉綠體、有絲分裂）、探究類實驗（如探究植物細胞的吸水和失水）、模擬實驗（如細胞大小與物質(zhì)運輸?shù)年P(guān)系實驗、滲透作用實驗），還有制備細胞膜等實驗。高考試題常以課本實驗為模本進行組合、拓展和遷移，特別注重對基本實驗操作步驟、原理、現(xiàn)象的考查。因此，平時訓練時要立足教材實驗，提高觀察能力、設(shè)計實驗的能力、分析實驗現(xiàn)象的能力。
最后，在復習中要形成如生物體結(jié)構(gòu)與功能相適應的觀點、生物體局部與整體相統(tǒng)一的觀點、生命活動的對立統(tǒng)一觀點，提高生物科學素養(yǎng)。
（二）高考命題預測
1.將線粒體與葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能及有關(guān)實驗與光合作用、呼吸作用過程原理融于一體進行命題，以此來考查學生的綜合應用能力。
二十世紀70年代Naftolin等的研究工作奠定了腦芳香化酶(Aromatase， AROM)假說的基礎(chǔ)，該假說認為在腦組織局部，AROM可以將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素（主要是雌二醇，E2）。以往的研究認為腦內(nèi)AROM的表達只見于出生前后一短暫時期，成年后則不表達，外周E2是成年腦E2的唯一來源。近年隨著研究技術(shù)的進步，在成年某些腦區(qū)如海馬、下丘腦也檢出AROM的表達，且不僅見于神經(jīng)元胞體也見于突觸前成分，證明成年腦仍然能夠合成E2［1］。目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩類E2受體，即經(jīng)典的核受體ERα和ERβ（Hawkins等從硬骨魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的核受體ERγ經(jīng)研究證實它是ERβ的一個亞型；見Filby AL，Biol Reprod， 2005)，以及近年新發(fā)現(xiàn)的膜性受體ERX以及屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族的GPR30和GαqER［2］。
1 經(jīng)典的雌激素受體
經(jīng)典的ERα和ERβ位于細胞核內(nèi)，它們通過調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮“基因型”調(diào)節(jié)效應。兩種經(jīng)典ER在腦內(nèi)的分布具有腦區(qū)特異性。如高表達的ERα見于下丘腦、終紋床核與生殖調(diào)節(jié)有關(guān)的腦區(qū)；ERβ高表達于嗅球、基底前腦、大腦皮質(zhì)、海馬錐體細胞、小腦浦肯野細胞、黑質(zhì)等與學習記憶、運動調(diào)控有關(guān)的腦區(qū)部位。腦垂體內(nèi)幾乎所有的催乳素陽性細胞都不表達ERβ，提示ERβ在泌乳中樞的調(diào)節(jié)可能有限的，而ERα對泌乳中樞的調(diào)節(jié)起著主要作用 。在功能方面，經(jīng)典ER介導的雌激素效應可能有所不同，但也可能協(xié)同發(fā)揮作用。如ERα主要參與對生殖調(diào)控的作用，因為阻斷ERα可改變動物的性行為；ERβ可能主要參與了對高級腦功能如學習記憶、神經(jīng)退行性疾病等的調(diào)節(jié)，因為敲除ERβ基因嚴重影響學習記憶行為、LTP和突觸強度 ［36］。
2 非經(jīng)典的膜性雌激素受體
E2能在數(shù)秒鐘內(nèi)改變神經(jīng)元的電生理特性、在幾分鐘之內(nèi)降低不表達核受體的神經(jīng)元的Ca2+電流，導致特異性增強基因表達的蛋白質(zhì)如MAPK途徑、PKA、CREB等的活化。這些效應受經(jīng)典ERs的膜性成分或近年新發(fā)現(xiàn)的膜性ER的介導，E2通過這一類ER主要發(fā)揮“非基因型”的調(diào)節(jié)作用，其信號轉(zhuǎn)導通路涉及到對Ca2+、cAMP等第二信使以及各蛋白激酶級聯(lián)的活化，如src、ras、MEK和MAPK。
2.1 膜性ERα
研究發(fā)現(xiàn)ERα也可位于細胞膜，甚至突觸后致密物即PSD。1～10 nm的E2在1 h內(nèi)能增強作為抑制學習記憶指標之一的長時程抑制即LTD，2 h內(nèi)能增加海馬CA1中錐體神經(jīng)元的樹突棘密度，然而CA3中錐體神經(jīng)元的棘樣結(jié)構(gòu)卻減少；實驗證明E2的快速調(diào)節(jié)作用是與通過細胞膜ERα而結(jié)合產(chǎn)生的。Hojo等因此認為海馬錐體細胞膜性ERα在誘導LTD和樹突棘再生中有重要作用，并認為這有助于“忘掉該忘掉的記憶”從而與細胞核ERβ協(xié)同發(fā)揮對學習記憶的調(diào)節(jié)作用［7］。
2.2 膜性ERβ
在某些腦區(qū)，ERβ也可能位于細胞核以外的部位，如胞漿，甚至突起內(nèi)，最早見于Li等1997年的報道。我們先前的免疫組化研究發(fā)現(xiàn)在成年大鼠CA1、CA2、動眼神經(jīng)核、藍斑下核等部位除了細胞核著色以外胞漿和突起也有淡淡的著色，三叉神經(jīng)運動核內(nèi)有一些僅為胞漿和突起著色的陽性細胞［4］。在研究生后大鼠基底前腦ERβ的發(fā)育學表達過程中，我們注意到在出生14 d后ERβ免疫陽性反應主要位于細胞核，但是胞漿和突起內(nèi)也可見到微弱的染色，其余時相點以及在小鼠均是位于細胞核，其生理意義上不清楚。Herrick等報道海馬齒狀回在新生或成年大鼠新生細胞的胞膜、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)檢測到ERβ免疫陽性反應，提示該部位細胞核外ERβ的表達可能與神經(jīng)干細胞的活動有關(guān)［8］。
2.3 ERX
該受體由ToranAllerand所在實驗室于2000年首次報道并做了幾篇研究報告，認為ERX介導了E2對MAPK/ERK通路的活化，其62kDa成分表達受到發(fā)育的調(diào)節(jié)，高表達的ERX見于野生型與ERα基因敲除鼠、轉(zhuǎn)基因AD模型鼠生后1～7 d而非成年的新皮質(zhì)、下丘腦、小腦，缺血性腦損傷或可以誘導其表達［9］。
2.4 GPR30
這是目前研究最多的一種膜性ER。它是一個具有7次跨膜結(jié)構(gòu)、375個氨基酸的G蛋白偶聯(lián)受體，與IL8受體有30%的同源性。1996年從B細胞cDNA文庫中分離出來，在巨噬細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中有廣泛表達。自1997年到2002年，較多文獻報道了GPR30在乳腺癌中的表達、調(diào)控與作用研究，2000年即發(fā)現(xiàn)E2對ERK的活化需要GPR30的參與，2005年德克薩斯大學的Thomas等正式提出GPR30是一種新的雌激素受體［1011］。
腦內(nèi)GPR30的功能研究方面目前報道還不多，已有資料表明它可能參與了雌激素對下丘腦促性腺激素釋放激素細胞內(nèi)突觸前GABA末梢對Ca2+的調(diào)節(jié)以及對海馬結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)節(jié)，在生后7 d以及成年鼠(hamster)的下丘腦、杏仁復合體與小腦發(fā)現(xiàn)有GPR表達的性別差異，提示該受體可能參與了對這些部位神經(jīng)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)［12］。
2.5 GαqER
2008年，Qiu等報道對小鼠和豚鼠的研究中發(fā)現(xiàn)下丘腦有一種調(diào)節(jié)GABAB受體去敏感化的ER，與GPR30一樣，它也屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，于是將其命名為GαqER。應用ERα和/或ERβ基因敲除小鼠證明它與上述兩種受體不同；通過GPR30基因敲除小鼠研究證明GαqER與GPR30也是不同的。它參與了對PLCPKCPKA途徑的調(diào)節(jié)， 具體過程可能是：① E2與該受體結(jié)合，引起Gαq的活化；②PLC被活化;③活化的PLC 水解PIP2并釋放DAG，游離DAG刺激PKCδ;④PKCδ 激活腺苷酸環(huán)化酶導致cAMP濃度升高;⑤cAMP刺激PKA;⑥PKA使細胞膜上與K+通道功能有關(guān)的靶蛋白磷酸化［1314］。
綜上所述，近年新發(fā)現(xiàn)的膜性ER尤其是經(jīng)典ER也可以位于細胞核外并發(fā)揮功能的研究打破了ER是核受體、只能位于細胞核的傳統(tǒng)觀念，對闡明E2在腦內(nèi)的功能及其機制發(fā)揮了巨大作用。兩種類型的ER并不是孤立地介導E2的作用，而是可以相互作用與整合以全面調(diào)節(jié)神經(jīng)元的功能，例如膜性E2受體可以導致經(jīng)典核受體及其輔助活化因子的磷酸化，誘導產(chǎn)生第三信使如Cyclin D1和cfos等從而也能調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。隨著研究手段的進步，將來也許還會發(fā)現(xiàn)更多的核ER或膜性ER，從而為深入認識和利用E2提供堅實的基礎(chǔ)。
參考文獻
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七年級生物上知識點第一單元 生物和生物圈
生物的特征：1、生物的生活需要營養(yǎng) 2、生物能進行呼吸 3、生物能排出體內(nèi)產(chǎn)生的廢物4、生物能對外界刺激做出反應 5、生物能生長和繁殖 6、由細胞構(gòu)成(病毒除外)
調(diào)查的一般方法
步驟：明確調(diào)查目的、確定調(diào)查對象、制定合理的調(diào)查方案、調(diào)查記錄、對調(diào)查結(jié)果進行整理、撰寫調(diào)查報告
生物的分類
按照形態(tài)結(jié)構(gòu)分：動物、植物、其他生物
按照生活環(huán)境分：陸生生物、水生生物
按照用途分：作物、家禽、家畜、寵物
生物圈是所有生物的家
生物圈的范圍：大氣圈的底部：可飛翔的鳥類、昆蟲、細菌等
水圈的大部：距海平面150米內(nèi)的水層
巖石圈的表面：是一切陸生生物的“立足點”
生物圈為生物的生存提供了基本條件：營養(yǎng)物質(zhì)、陽光、空氣和水，適宜的溫度和一定的生存空間
環(huán)境對生物的影響
非生物因素對生物的影響：光、水分、溫度等
光對鼠婦生活影響的實驗P15
探究的過程：1、提出問題 2、作出假設(shè) 3、制定計劃 4、實施計劃 5、得出結(jié)論 6、表達和交流
對照實驗 P15
生物因素對生物的影響：
最常見的是捕食關(guān)系，還有競爭關(guān)系、合作關(guān)系
生物對環(huán)境的適應和影響
生物對環(huán)境的適應P19的例子
生物對環(huán)境的影響：植物的蒸騰作用調(diào)節(jié)空氣濕度、植物的枯葉枯枝腐爛后可調(diào)節(jié)土壤肥力、動物糞便改良土壤、蚯蚓松土
生態(tài)系統(tǒng)的概念：在一定地域內(nèi)，生物與環(huán)境所形成的統(tǒng)一整體叫生態(tài)系統(tǒng)。一片森林，一塊農(nóng)田，一片草原，一個湖泊，等都可以看作一個生態(tài)系統(tǒng)。
生態(tài)系統(tǒng)的組成：
生物部分：生產(chǎn)者、消費者、分解者
非生物部分：陽光、水、空氣、溫度
如果將生態(tài)系統(tǒng)中的每一個環(huán)節(jié)中的所有生物分別稱重，在一般情況下數(shù)量做大的應該是生產(chǎn)者。
植物是生態(tài)系統(tǒng)中的生產(chǎn)者，動物是生態(tài)系統(tǒng)中的消費者，細菌和真菌是生態(tài)系統(tǒng)中的分解者。
食物鏈和食物網(wǎng)：
食物鏈以生產(chǎn)者為起點，終點為消費者，且是不被其他動物捕食的“最高級”動物。
物質(zhì)和能量沿著食物鏈和食物網(wǎng)流動的。
營養(yǎng)級越高，生物數(shù)量越少;營養(yǎng)級越高，有毒物質(zhì)沿食物鏈積累(富集)。
生態(tài)系統(tǒng)具有一定的自動調(diào)節(jié)能力。
在一般情況下，生態(tài)系統(tǒng)中生物的數(shù)量和所占比例是相對穩(wěn)定的。但這種自動調(diào)節(jié)能力有一定限度，超過則會遭到破壞。
例如：在草原上人工種草，為了防止鳥吃草籽，用網(wǎng)把試驗區(qū)罩上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)罩內(nèi)的草的葉子幾乎被蟲吃光，而未加網(wǎng)罩的地方，草反而生長良好。原因是：食物鏈被破壞而造成生態(tài)系統(tǒng)平衡失調(diào)。
生物圈是最大的生態(tài)系統(tǒng)。人類活動對環(huán)境的影響有許多是全球性的。
生態(tài)系統(tǒng)的類型p29
森林生態(tài)系統(tǒng)、草原生態(tài)系統(tǒng)、農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)、海洋生態(tài)系統(tǒng)、城市生態(tài)系統(tǒng)等
生物圈是一個統(tǒng)一的整體p30
注意DDT的例子 (富集)課本26頁。
課本27頁1題33頁生物圈2號
生物的生存依賴于環(huán)境，以各種方式適應環(huán)境，影響環(huán)境。
七年級生物上知識點第二單元 生物和細胞
顯微鏡的結(jié)構(gòu)
鏡座：穩(wěn)定鏡身;
鏡柱：支持鏡柱以上的部分;
鏡臂：握鏡的部位;
載物臺：放置玻片標本的地方。中央有通光孔，兩旁各有一個壓片夾，用于固定所觀察的物體。
遮光器：上面有大小不等的圓孔，叫光圈。每個光圈都可以對準通光孔。用來調(diào)節(jié)光線的強弱。
反光鏡：可以轉(zhuǎn)動，使光線經(jīng)過通光孔反射上來。其兩面是不同的：光強時使用平面鏡，光弱時使用凹面鏡。
鏡筒：上端裝目鏡，下端有轉(zhuǎn)換器，在轉(zhuǎn)換器上裝有物鏡，后方有準焦螺旋。
準焦螺旋：粗準焦螺旋：轉(zhuǎn)動時鏡筒升降的幅度大;細準焦螺旋。
轉(zhuǎn)動方向和升降方向的關(guān)系：順時針轉(zhuǎn)動準焦螺旋，鏡筒下降;反之則上升
顯微鏡的使用 P37-38 的圖要掌握
觀察的物像與實際圖像相反。注意玻片的移動方向和視野中物象的移動方向相反。
放大倍數(shù)=物鏡倍數(shù)X目鏡倍數(shù)
放在顯微鏡下觀察的生物標本，應該薄而透明，光線能透過，才能觀察清楚。因此必須加工制成玻片標本。
觀察植物細胞：實驗過程P43-44
切片、涂片、裝片的區(qū)別 P42
植物細胞的基本結(jié)構(gòu)
細胞壁：支持、保護
細胞膜：控制物質(zhì)的進出，
細胞質(zhì)：液態(tài)的，可以流動的。細胞質(zhì)里有液泡，液泡內(nèi)的液泡內(nèi)溶解著多種物質(zhì)(如糖分)
細胞核：貯存和傳遞遺傳信息
葉綠體：進行光合作用的場所，
液泡：細胞液
觀察口腔上皮細胞實驗P47
動物細胞的結(jié)構(gòu)
細胞膜：控制物質(zhì)的進出
細胞核：貯存和傳遞遺傳信息
細胞質(zhì)：液態(tài)，可以流動
植物細胞與動物細胞的相同點：都有細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核
植物細胞與動物細胞的不同點：植物細胞有細胞壁和液泡，動物細胞沒有。
細胞的生活需要物質(zhì)和能量
細胞是構(gòu)成生物體的結(jié)構(gòu)和功能基本單位。
細胞是物質(zhì)、能量、和信息的統(tǒng)一體。細胞通過分裂產(chǎn)生新細胞。
細胞中的物質(zhì)
有機物(一般含碳，可燒)：糖類、脂類、蛋白質(zhì)、核酸，這些都是大分子
無機物(一般不含碳)：水、無機物、氧等，這些都是小分子
細胞膜控制物質(zhì)的進出，對物質(zhì)有選擇性，有用物質(zhì)進入，廢物排出。注意課本52頁圖叫什么
細胞內(nèi)的能量轉(zhuǎn)換器：
葉綠體：進行光合作用，是細胞內(nèi)的把二氧化碳和水合成有機物，并產(chǎn)生氧。線粒體：進行呼吸作用，是細胞內(nèi)的“動力工廠”“發(fā)動機”。
二者聯(lián)系：都是細胞中的能量轉(zhuǎn)換器
二者區(qū)別：葉綠體將光能轉(zhuǎn)變成化學能儲存在有機物中;
線粒體分解有機物，將有機物中儲存的化學能釋放出來供細胞利用。
動植物細胞都有線粒體。
細胞核是遺傳信息庫，遺傳信息存在于細胞核中
多莉羊的例子p55，
57頁1題
細胞核中的遺傳信息的載體——DNA
DNA的結(jié)構(gòu)像一個螺旋形的梯子
基因是DNA上的一個具有特定遺傳信息的片斷
DNA和蛋白質(zhì)組成染色體
不同的生物個體，染色體的形態(tài)、數(shù)量完全不同
同種生物個體，染色體在形態(tài)、數(shù)量保持一定
染色體容易被堿性染料染成深色
染色體數(shù)量要保持恒定，否則會有嚴重的遺傳病
細胞的控制中心是細胞核
細胞通過分裂產(chǎn)生新細胞
生物的由小長大是由于：細胞的分裂和細胞的生長
細胞的分裂
1、染色體進行復制
2、細胞核分成等同的兩個細胞核
3、細胞質(zhì)分成兩份
4、植物細胞：在原細胞中間形成新的細胞膜和細胞壁
動物細胞：細胞膜逐漸內(nèi)陷，便形成兩個新細胞
新生命的開端---受精卵
經(jīng)細胞分化形成的各種各樣的細胞各自聚集在一起才能行使其功能，這些形態(tài)結(jié)構(gòu)相似、功能相同的細胞聚集起來所形成的細胞群叫做組織。
不同的組織按一定的次序結(jié)合在一起構(gòu)成器官。
動物和人的基本組織可以分為四種：上皮組織、結(jié)締組織、肌肉組織、神經(jīng)組織。
四種組織按照一定的次序構(gòu)成，并且以其中的一種組織為主，形成器官。
能夠共同完成一種或幾種生理功能的多個器官按照一定的次序組成在一起構(gòu)成系統(tǒng)。
系統(tǒng)：運動系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)。
動物和人的基本結(jié)構(gòu)層次(小到大)：細胞→組織→器官→系統(tǒng)→動物體和人體
植物結(jié)構(gòu)層次(小到大)：細胞→組織→器官→植物體
P65題3
第二節(jié) 植物體的結(jié)構(gòu)層次
綠色開花植物的六大器官
營養(yǎng)器官：根、莖、葉 ;
生殖器官：花、果實、種子
第三節(jié) 只有一個細胞的生物體
單細胞生物：草履蟲、酵母菌、、衣藻、眼蟲、變形蟲
關(guān)鍵詞： 核轉(zhuǎn)錄因子κB;核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制因子;中性粒細胞;凋亡
急性肺損傷、急性胰腺炎等炎癥反應過程中，中性粒細胞首先浸潤于炎癥灶中，并可能過度活化導致全身炎癥反應綜合征〔1〕。核轉(zhuǎn)錄因子κB（NFκB）作為多種介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，不僅參與炎癥介質(zhì)的調(diào)控，同時也對中性粒細胞凋亡基因的表達調(diào)控有重要作用。因此，NFκB自身的活性狀況對炎癥進程有至關(guān)重要的作用。本研究通過脂多糖(LPS)刺激中性粒細胞，探討NFκB天然抑制調(diào)節(jié)因子IκBα對中性粒細胞凋亡的影響。
1 材料與方法
1.1 材料
LPS、來普霉素B（leptomycin B，LMB）購自深圳晶美生物公司，IκBα單抗、Western印跡試劑盒購自武漢博士德公司,Trans AMTM NFκBp65 kit 為大連寶生物公司產(chǎn)品。細胞核漿蛋白制備試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。
1.2 中性粒細胞分離培養(yǎng)及細胞核、漿蛋白制備
2 w內(nèi)未服用藥物的健康成人志愿者（為獻血員），參照文獻〔2〕進行中性粒細胞分離純化。純化后的細胞懸浮于含10%胎牛血清的RPMI1640溶液中至終濃度為5×109/L,于37℃振蕩培養(yǎng)。將離體培養(yǎng)的中性粒細胞分為4組：（1）生理鹽水對照組（A組）；（2）LMB干預組（B組）；（3）LPS刺激組（C組）；LMB+LPS組（D組）。LPS刺激的終濃度為0.1 g/L；LMB+LPS組中，予LPS刺激前45 min加入1‰（V/V）LMB。應用北京博奧森生物技術(shù)有限公司細胞核漿蛋白制備試劑盒提取核漿蛋白，步驟參照說明書進行。應用Bradford法測定制備蛋白濃度。
1.3 細胞核NFκB活性檢測
采用Trans AMTM NFκBp65 試劑盒進行檢測。以不加入核提取物為空白對照，實驗組中每個時相點進行5次測定，讀取分光光度計450 nm處A值進行統(tǒng)計學處理。
1.4 細胞核、漿IκBα含量檢測
將提取的各組細胞核、漿蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDSPAGE）蛋白電泳。上樣量20 μg，90 V電泳2 h后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。5%（W/V）脫脂奶粉封閉1h,加入兔抗IκBα多克隆抗體（1∶200）4℃過夜，羊抗兔Ⅱ抗（1∶5 000）室溫下孵育1 h。應用化學發(fā)光試劑盒進行檢測，凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描分析，并用測得目的條帶的灰度×面積表示結(jié)果。
1.5 中性粒細胞凋亡的檢測
采用流式細胞儀DNA倍體分析法：收集1×105個中性粒細胞，1 000 r/min離心5 min,棄培養(yǎng)液，用PBS液洗2次后加入70%冷乙醇2 ml混勻，4℃固定30 min。再以1 000 r/min離心5 min,棄培養(yǎng)液，用PBS洗2次后加入1 ml碘化丙啶（PI）染色，4℃孵育30 min，上機分析。
1.6 統(tǒng)計學處理
以SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析，以x±s表示，進行t檢驗。
2 結(jié) 果
2.1 細胞核NFκB活性檢測結(jié)果
LMB干預組細胞核NFκB活性(0.041 2±0.003 1)與對照組(0.042 1±0.003 3)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。給予LPS刺激后，NFκB活性(0.622 0±0.053 6)較對照組顯著增強(P＜0.05)；而給予LPS刺激的同時加入LMP，NFκB活性(0.050 0±0.003 6)明顯受到抑制。
2.2 細胞核、漿IκBα含量檢測結(jié)果
細胞核、漿IκBα Western印跡結(jié)果見圖1。細胞核、漿IκBα凝膠圖像掃描結(jié)果見表1。對照組、LMB干預組胞漿與胞核中IκBα含量無顯著性差異；LPS刺激組中胞漿含量略低于胞核(P＜0.05)，且LPS刺激組胞漿及胞核中含量均低于對照組(P＜0.05)；LMB+LPS組胞漿明顯低于胞核。表1 細胞核、漿IκBα凝膠圖像掃描結(jié)果（略)
2.3 中性粒細胞凋亡檢測結(jié)果
見圖2。與對照組相比，LMB干預組中性粒細胞凋亡百分比無明顯改變；而LPS刺激組顯著下降(P＜0.05)。LMB+LPS組與LPS刺激組比較，中性粒細胞凋亡百分比明顯上升(P＜0.05)。
3 討 論
中性粒細胞作為機體內(nèi)最活躍的炎癥細胞，在臟器內(nèi)大量扣押、活化是導致急性肺損傷等炎性疾病惡化的中心環(huán)節(jié)。激活的中性粒細胞通過呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量自由基、蛋白水解酶及炎癥介質(zhì)等有害物質(zhì)造成組織損傷。適度清除中性粒細胞是控制炎癥發(fā)展的重要措施。凋亡的中性粒細胞脫顆粒、呼吸爆發(fā)等致炎功能下降，而且更易被吞噬細胞吞噬。被整體吞噬的中性粒細胞致炎能力顯著下降。因此，凋亡作為中性粒細胞重要的非炎性清除方式，對炎癥疾病轉(zhuǎn)歸有重要作用〔3，4〕。
【關(guān)鍵詞】胰腺內(nèi)分泌腫瘤 臨床病理學 免疫組化特點分析
【Summary】：To pick: ：To the advancement of pathological and the clinical characteristics of the immunity. the method of 23 respectively， for example， pets and pas， immune to the organization ’s - chemical (p method dyeing) observation. the example the average age of 23 pets 42. four years， there was a tumor. part 2， there is more solid envelope lump， they will be poor. the organization， lymphoma cells in a small circular， streaming. the thin cell in quality in nuclear chromatin Fine grainy. cells in trabecula ， glands make or truth. immunization group ： 23 cases in the pets syn 13， and 10 nse cga ck 7 and ins 6 cases. the positive conclusion ： endocrine the tumor may the man of unusual characteristics and clinical psychologists immunization form.
【Keywords】：The key words：The endocrine the tumor， clinical pathology， the analysis of the characteristics of immunity
免疫組織化學：預后胰腺內(nèi)分泌腫瘤(pancreaticendocrinetumors，PETs)僅占所有胰腺腫瘤的1%～2%是臨床上非常少見的腫瘤。筆者對收集的PETs病例進行臨床回顧性研究，探討PETs的臨床病理學特征、免疫表型及預后。
1、臨床資料
選取本院2001～2006年病理診斷為PETs的資料齊全病例共18例，經(jīng)兩位病理主任醫(yī)師重復閱片確診。18例PETs患者中5例因上腹部不適，3例因偶然發(fā)現(xiàn)上腹部腫塊，7例因反復頭暈乏力而入院就診。1例腫塊為多發(fā)，其余均為單發(fā)。B超10例示胰腺腫塊，3例示后腹膜塊，1例示膽總管后腫塊。CT示7例胰腺實性腫塊。18例隨訪1.5～5年，2例復發(fā)。標本經(jīng)10%的福爾馬林固定、石蠟包埋，4μm厚切片，HE染色、PAS染色及免疫組化染色。
免疫組化抗體：抗糜蛋白酶(AACT)、波形蛋白(Vim)、突觸素(Syn)、嗜鉻粒蛋白(CgA)、神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)、細胞角蛋白(CK)、胰島素(Ins)均為福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品，方法為S-P法，使用LabVision全自動免疫組化染色系統(tǒng)(美國)。每次染色設(shè)陰性及陽性對照。
2、病理檢查結(jié)果
2.1巨檢11例手術(shù)切除PETs腫塊標本，1例為灰白色，余均為褐色或粉紅色，腫塊與周圍組織分界清楚。6例有完整包膜，1例有部分包膜，4例無明顯包膜。直徑1.5～5.5cm，平均直徑2.4cm。10例切面為實性質(zhì)軟(其中3例有出血)，1例切面為囊實性，囊內(nèi)有出血。
2.2鏡檢23例PETs中部分腫塊有厚薄不均勻的纖維包膜，腫瘤細胞由形態(tài)相對一致的小圓形細胞構(gòu)成，胞漿嗜酸性或嗜雙色性，細胞核居中，核染色質(zhì)呈細顆粒狀、腫瘤細胞排列成小梁狀、腺胞狀或?qū)嵭浴ｉg質(zhì)有豐富的血管。惡性PETs可見包膜浸潤和周圍淋巴結(jié)、腸系膜等轉(zhuǎn)移。6例腫瘤細胞核異型明顯。
2.3生物學行為與預后病例1有胰腺、周圍脂肪組織、小灶性血管侵犯病例4有包膜、血管侵犯以及胰周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例5有包膜侵犯病例10有腸系膜轉(zhuǎn)移病例11有肝轉(zhuǎn)移且腫塊為多發(fā)性，4例確診為惡性經(jīng)手術(shù)后隨訪2例復發(fā)。
3、討論
3.1臨床特征PETs好發(fā)于成年人，女性多于男性2、本文報道的23例PETs中7例為男性，16例為女性，患者的平均年齡為42.4歲，PETs分為功能性和非功能性兩類。大多數(shù)PETs為功能性，而非功能性僅占其中的15%左右。非功能性PETs通常沒有明顯的臨床內(nèi)分泌紊亂癥狀，患者多以上腹部不適或偶發(fā)上腹部包塊就診。而功能性PETs可因腫瘤分泌的主要激素不同而分為不同的亞型，它們各自都有特征性的臨床癥狀。胰島素瘤是最常見的功能性PETs。影像學所見對于PETs的術(shù)前定位及定性診斷有重要價值。B超與CT不僅能顯示胰腺全貌，而且還能顯示周圍器官及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移，為術(shù)前判定腫瘤良惡性、術(shù)式選擇及切除范圍提供依據(jù)。實驗室檢測血糖濃度、血漿激素水平等生化指標對功能性PETs的診斷也有重要價值。
關(guān)鍵詞：紅瘰疣螈（Tylototriton verrucoosus Anderson）;消化系統(tǒng);消化腺
中圖分類號：Q945.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）12-2846-04
Microanatomy Observation of Digestive System in Tylototriton verrucoosus Anderson
XIAO Xiao-liu，PENG Dong-yan，DU-qin，LI Hong-mei
（Yuxi Normal University， Yuxi 653100，Yunnan，China）
Abstract： In this experiment， paraffin-embedded， HE staining， conventional continuous slice were adopted on digestive histological observation of Tylototriton verrucoosus Anderson. The results showed that the esophagus of Tylototriton verrucoosus Anderson consisted of epithelial cells， mucosal layer， submucosa， muscle layer， esophageal glands， goblet cells， outer membrane; and the stomach composed of epithelial cells， folds， submucosa， gastric pits， tunica propria， muscle layers and gastric gland. The duodenum， ileum， rectum were made of the epithelial cells， folds， goblet cells， muscle layers. The gastrointestinal epithelium was simple columnar cells. The esophagus had groups of esophageal glands， thick mucous layer which folded inward to form plica， and developed single tubular gastric gland. The intestinal were rich of goblet cells yet least in duodenum and gradually increasing in ileum and rectum.
Key words： Tylototriton verrucoosus Anderson; digestive system; digestive gland
紅瘰疣螈（Tylototriton verrucoosus Anderson）是兩棲綱（Amphibia）有尾目（Caudata）蠑螈科（Salamandridae）疣螈屬（Tylototriton）的代表動物之一，云南省主要分布于麗江、騰沖、保山、景洪、新平等地區(qū)[1]。體色因其生活環(huán)境而有所差異[2]，指4，趾5。主要以蚯蚓、蜈蚣、步行蟲、蝸牛、黃粉蟲等為食，為雜食性動物。紅瘰疣螈屬于水生脊椎動物向陸生脊椎動物過渡階段的一個類群，其生活環(huán)境特殊，因而其對研究動物系統(tǒng)進化有重要意義[3]。目前，中國有很多學者對紅瘰疣螈做了研究，例如，從線粒體Cyt b基因探討紅瘰疣螈物種地位的有效性[4]、體溫調(diào)節(jié)[5]、繁殖生態(tài)[6，7]、皮膚顯微結(jié)構(gòu)觀察[8]等。本研究對紅瘰疣螈消化系統(tǒng)做了組織學研究，并與其他動物作比較，探究其內(nèi)部構(gòu)造對其生活環(huán)境的適應性，也為兩棲動物組織學研究提供基礎(chǔ)資料。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗所用活體紅瘰疣螈采自云南鳳慶縣小灣鎮(zhèn)，3雌1雄，平均體長15.5～18.6 cm，游標卡尺測量。平均體重14.4～22.1 g，雌性個體比雄性個體大，體色鮮艷且生長狀況良好。
1.2 方法
取消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)各部分組織用8%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)石蠟切片，切片厚度一般為5 μm左右，經(jīng)HE染色，顯微鏡拍照，觀察。
2 結(jié)果與分析
為敘述方便起見，將紅瘰疣螈消化道分為食道、胃、十二指腸、回腸、直腸。
2.1 消化系統(tǒng)的組織結(jié)構(gòu)
紅瘰疣螈的食道由固有膜和單層上皮細胞共同向食道腔形成多個褶皺（圖1-1），皺襞高度為153.6～706.4 μm 。黏膜上皮為單層柱狀上皮，黏膜層厚度為67.2～124.8 μm。表皮細胞有4～6層，細胞核橢圓形，位于細胞基底部，厚度為57.6～134.4 μm。表皮細胞間有杯狀細胞，大小為9.6～38.4 μm。黏膜基底層上皮細胞呈矮柱狀，細胞核呈圓形或橢圓形，黏膜基底層可見不甚明顯的泡狀食管腺，黏膜下層為疏松結(jié)締組織（圖1），其間分布有血管、神經(jīng)和空泡狀細胞，其下為肌肉層，肌肉層由平滑肌構(gòu)成內(nèi)環(huán)外縱兩層，其間還有扁平狀的漿細胞。外膜由外向內(nèi)由漿膜和纖維膜構(gòu)成，漿膜厚105.6～192.0 μm，纖維膜厚度為1.5 μm左右。
胃可分為賁門胃、胃體和幽門胃三部分。紅瘰疣螈胃的腔面里有10～12個褶皺組成的皺襞群（圖1-2），高度為163.2～556.8 μm，由黏膜層和黏膜下層組成。黏膜上皮為單層柱狀細胞，大小為3.4～6.8 μm，細胞核為橢圓形被染成深紫色，位于細胞基底部，細胞質(zhì)被染成粉紅色，嗜酸性。胃黏膜上皮下陷到固有膜形成單管狀胃腺，且胃腺發(fā)達，細胞核大且呈圓形或近似于圓形，位于細胞中央。黏膜下層由疏松結(jié)締組織組成，在結(jié)締組織之間有成堆的脂肪細胞和血管，以及壁細胞和頸黏液細胞，壁細胞近似于圓形，細胞核呈圓形且位于細胞中央，頸黏液細胞為長柱狀細胞，細胞核橢圓形，位于細胞基部。胃肌肉層由內(nèi)層環(huán)肌和外層縱肌構(gòu)成，環(huán)肌較厚，占肌肉層的2/3，最外層膜為一層纖維膜。
紅瘰疣螈十二指腸黏膜層較發(fā)達（圖1-3），黏膜上皮為單層柱狀上皮。黏膜向腸腔內(nèi)形成10～15個皺襞，皺襞高201.0～668.4 μm，皺襞的表層有較豐富的絨毛，絨毛高9.6～28.8 μm，其下為高柱狀細胞，在小腸中數(shù)量最多，大小為7.8～14.4 μm，細胞核橢圓形或長橢圓形，位于細胞中央，大小為4.8～7.8 μm。在柱狀細胞中有巨型杯狀細胞，杯狀細胞為長橢圓形，個體較大。固有膜內(nèi)分布著腸腺，還可見少量的乳糜管。黏膜肌層較胃肌層薄，由內(nèi)環(huán)外縱兩層平滑肌組成，環(huán)肌較厚，縱肌較薄，兩層肌肉之間有疏松結(jié)締組織連接，可見微血管，黏膜下層為疏松結(jié)締組織，分布有血管、神經(jīng)等。
紅瘰疣螈黏膜向腸腔內(nèi)形成多個以單個個體形式存在的皺襞（圖1-4），黏膜上皮為單層柱狀上皮，黏膜表層有一層絨毛（圖1-5），柱狀細胞數(shù)目較多，大小為23.5～35.8 μm，細胞核大多為圓形，少數(shù)為橢圓形，較小，位于細胞中央。在柱狀細胞中有杯狀細胞，呈短橢圓形，直腸中最多（表1）。肌層較明顯，但不發(fā)達，內(nèi)環(huán)外縱，環(huán)肌較薄，縱肌較厚。
直腸黏膜上皮為單層柱狀上皮（圖1-6），具微絨毛，柱狀細胞數(shù)目最多，細胞呈橢圓形或圓形，細胞核近圓形，位于細胞中央，柱狀細胞中還分布有較多的杯狀細胞，杯狀細胞近似于圓形。直腸肌肉層環(huán)肌和縱肌同等發(fā)達，內(nèi)環(huán)外縱，縱肌上分布有脂肪細胞。
2.2 消化腺的組織結(jié)構(gòu)
由單層柱狀細胞及肌肉層組成（圖1-7），細胞層排列整齊緊密，大小為1.0～12.5 μm細胞為橢圓形，相鄰細胞分界不明顯，細胞核呈橢圓形，位于細胞中央。肌肉層較薄，厚度為15～50 μm，為單層的縱肌，其間分布有脂肪細胞。
在40倍光學顯微鏡下觀察到肝小葉之間分界不明顯，肝小葉分界處有肝管（圖1-8），在肝小葉的中央有一條中央靜脈（圖1-9），管徑小，靜脈腔不明顯。肝細胞呈不規(guī)則的多邊形，分界清楚，胞質(zhì)豐富，呈顆粒狀，部分肝細胞出現(xiàn)空泡和空隙（圖1-8）。細胞核呈圓形或橢圓形，位于細胞中央。肝細胞由6～10個圍繞中央靜脈呈放射狀排列成肝細胞索（圖9），大小為33.6～76.8 μm，肝細胞索之間形成的空隙為竇狀隙，竇狀隙呈狹長型，其內(nèi)可見殘留的血細胞。此外，肝實質(zhì)內(nèi)有黑色顆粒聚縮形成黑色素團，體積大小不一樣，分布也不均勻，其間分布有肝血竇。肝的表面為一層薄薄的漿膜，結(jié)締組織少，緊接著結(jié)締組織是由5～6層單層扁平細胞組成的表皮細胞。
外膜為一薄層結(jié)締組織（圖1-10），胰腺細胞形狀不規(guī)則，細胞核橢圓形，位于細胞基底。排泄管貫穿于腺細胞之間，排泄管內(nèi)可見分泌物（圖1-11），經(jīng)HE染色后呈紅色，嗜酸性。
3 討論
紅瘰疣螈處于水生到陸生的過渡階段，它的消化系統(tǒng)需要面臨由水生生活轉(zhuǎn)變?yōu)殛懮顜淼男蛄袉栴}，所以在結(jié)構(gòu)上有一序列相應的特征之與相適應。
3.1 紅瘰疣螈消化道與其他兩棲類動物的比較
從解剖學上來講紅瘰疣螈食道短而粗，利于紅瘰疣螈在捕食時將整個食物都吞進去，與大鯢[9]相似。從組織學上來講，紅瘰疣螈食管內(nèi)有縱行的皺襞，當吞咽食物時，皺襞平展，這就大大擴大了食道管腔的面積，且皺襞上有黏液細胞，可以分泌黏液以濕潤食物助于吞咽。紅瘰疣螈黏膜下層相對較厚，增強了消化道各部分組織的舒展性，使食物在消化道中得到充分的消化吸收，與鰱魚[10]黏膜下層較薄有差異，這一點說明紅瘰疣螈在進化過程中細胞分化更為完全。在食道黏膜下層分化出體積大小不等的兩種杯狀細胞，與中華蟾蜍[11]、版納魚螈[12]食道黏膜上皮細胞中的杯狀細胞相似，其主要功能是分泌蛋白[13]，起作用，能夠保護消化道并利于食物順利通過。與版納魚螈等有尾及大多無尾兩棲類[11，14，15]相似，都有食道腺，但與版納魚螈[12]不同，版納魚螈食道腺為團泡狀腺，紅瘰疣螈為單管狀食道腺。食道最外層為漿膜層，與鰱魚[10]漿膜層相似，由扁平細胞組成。
紅瘰疣螈胃內(nèi)壁較粗大的皺襞和發(fā)達的肌肉結(jié)合，大大增加了胃的舒展性，可以容納體積較大的食物，而花背蟾蜍[16]胃中皺襞更加發(fā)達，為5～7條縱行的皺襞組成且胃中皺襞高度相對其他組織高，這表明它的胃具有較強的舒張性，皺襞高就使得食物在胃中停留時間延長。胃的上表皮有豐富的單層柱狀上皮細胞和頸黏液細胞、壁細胞，它們共同促進了胃對食物的蠕動。胃里還有豐富的胃腺，分泌胃液，使食物得到濕潤，有利于食物的消化吸收，這些結(jié)構(gòu)的結(jié)合使得食物得到初步的消化并被迅速送到腸內(nèi)。
紅瘰疣螈的十二指腸、回腸、直腸有高度不同的皺襞，從前到后皺襞逐漸變矮，皺襞在食物消化過程中起到了屏障作用，使食物在消化道內(nèi)停留的時間加長。小腸內(nèi)壁有豐富的絨毛，增加了食物與腸道的接觸面積，使食物的消化吸收更加充分，同時絨毛還具有緩沖作用，可預防食物對消化道的機械損傷。十二指腸中有豐富的絨毛（高9.6～28.8 μm），體現(xiàn)了十二指腸的重吸收作用，但沒有中華蟾蜍[11]絨毛發(fā)達（高40.8～52.8 μm）。腸中有豐富的杯狀細胞，食道、十二指腸、回腸、直腸中數(shù)目依次增加，與文縣疣螈[17]相似，在排便過程中水分得到重吸收，體內(nèi)水分得到保持，干燥的糞便順利排出體外，減少對水分的散失，更加適應陸地生活。
3.2 紅瘰疣螈消化腺與其他兩棲類動物的比較
紅瘰疣螈肝臟較發(fā)達，肝細胞為不規(guī)則多邊形，細胞核較大，位于細胞中央，呈圓形。肝細胞中還有大量的空泡和空隙，與大涼疣螈相似，李蓓等[18]在成體大涼疣螈肝臟的組織形態(tài)學觀察中認為肝臟細胞質(zhì)空泡和空隙中分布著脂質(zhì)和糖原，是重要的儲能器官。紅瘰疣螈與大涼疣螈為同一屬的動物，因此也認為紅瘰疣螈肝臟細胞的空泡和空隙有脂質(zhì)和糖原的分布，能儲存更多的能量。肝實質(zhì)內(nèi)還有黑色素顆粒組成的黑色素團，且成堆存在，經(jīng)分析認為，這與已報道的蠑螈科[18]種類相似，是低氧環(huán)境下保護性適應的結(jié)果。肝臟還是重要的代謝器官，發(fā)達的肝細胞增強了紅瘰疣螈的代謝功能，紅瘰疣螈肝臟細胞特點與其功能相適應。
致謝：感謝李澤君老師及茶云肖、段生麗同學對本項目研究提供的幫助。
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乙肝是一類大病，在我國感染人數(shù)有1到2億，目前國內(nèi)或者國外對于乙肝的治療主要方法還是抗病毒保肝護肝的治療。主要是由于乙型肝炎病毒cccDNA在感染者肝內(nèi)長期存在，并作為HBV復制的模板，成為根治乙型肝炎病毒感染的困難所在。然而，患者的病情往往會反反復復，即使對于患者的病情控制的非常得當，也只能在一段時間內(nèi)起到較好的效果。如何能夠徹底的治愈，現(xiàn)在還沒有很好的方案，因此，準確地檢測肝內(nèi)和/或血清HBV cccDNA的量對病情判斷、療效評估和預后均有重要的意義。
1 HBV 感染與復制過程
1.1感染途徑 ：乙型肝炎病毒感染人體主要是通過血液傳播，大多數(shù)情況通過注射；二是通過母嬰傳播；其次性傳播。無論通過哪個途徑，乙肝病毒進入血液循環(huán)在體內(nèi)流動，會經(jīng)過人體的一個非特異性免疫清除，在血液循環(huán)里面要經(jīng)過吞噬細胞的吞噬。病毒在循環(huán)中突破了這些屏障，游離到它需要復制的靶位，即肝細胞。病毒進入肝細胞復制，首先要使肝細胞接受它，也就是說肝細胞上要有受體與病毒結(jié)合。病毒可以依靠肝細胞的細胞膜的某一部分，通過胞引作用進到肝細胞內(nèi)。病毒可以在此釋放核酸，核酸在肝細胞內(nèi)依靠細胞內(nèi)的原料進行復制和合成。1.2復制與免疫應答：病毒一旦在肝細胞內(nèi)復制，肝細胞就會有核酸出現(xiàn)，核酸產(chǎn)生后核心抗原就會相應的出現(xiàn)。核心抗原會包裹核酸，但由于核酸分子較小，包裹以后會有多余的一部分結(jié)構(gòu)。多余的部分可以被核內(nèi)的一些酶切掉，這一部分就是 E 抗原。因此 E 抗原的存在就是乙肝病毒復制的一個標志。 E 抗原從肝細胞釋放到細胞以外，血液循環(huán)里面就能夠檢測到 E 抗原的存在。人體的免疫細胞就會通過免疫的應答產(chǎn)生相應的抗體，即 E 抗體。在病毒復制的初期， E 抗原產(chǎn)生的量要大于抗體，因此這時檢測到的是 E 抗原而 E 抗體檢測不到。如果病毒處于復制的高峰期，釋放的抗原在血液循環(huán)內(nèi)增加，特別是大蛋白的抗原，包括表面抗原的大蛋白，就可以誘導的人體細胞對它進行識別和應答。1.3免疫損傷：人體除在血液循環(huán)內(nèi)對抗原進行應答之外，含有病毒復制的肝細胞還會有細胞膜結(jié)構(gòu)的一些變化。這些變化可以誘導人體的免疫細胞，對有病毒的肝細胞進行免疫應答，從而對該細胞進行殺傷，使肝細胞發(fā)生免疫損傷，細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶就會釋放到血液循環(huán)內(nèi)，細胞核也會破碎從而把細胞內(nèi)的物質(zhì)釋放出來，這就是免疫應答的過程，導致了免疫損傷。因此也導致了我們所說的肝功能損害，通過一些生化指標的監(jiān)測可以監(jiān)測到肝功的損害。1.4cccDNA 的形成：乙肝是慢性疾病，乙肝病毒在肝細胞內(nèi)是連續(xù)傳代。病毒一旦進入肝細胞以后就會開始復制，復制出的病毒就會從肝細胞里面釋放出來，而釋放出來的病毒除了被人體免疫系統(tǒng)進行識別和殺傷之外，還有一部分會再侵犯其他的肝細胞，并在其他肝細胞里面再進行這樣的復制，如此循環(huán)。能夠在肝細胞里復制的病毒是有活性的，這種乙肝病毒它的 DNA 是松散的雙鏈結(jié)構(gòu)。它是個這種雙鏈結(jié)構(gòu)是松散的而不是閉合的環(huán)結(jié)構(gòu)。但是，有些病毒的核酸在進到肝細胞的細胞核以后，在 DNA 聚合酶的作用下，將環(huán)形松散的缺口補齊，變成一個超螺旋的共價、閉合、環(huán)狀 DNA ，即 cccDNA 。
2 HBV cccDNA 的概念及意義
2.1“睡眠”的病毒 DNA：cccDNA 形成之后狀態(tài)比較穩(wěn)定，可以稱其為肝細胞核內(nèi)“睡眠”的病毒 DNA ，當病毒活躍性復制時，它又可以作為一個模塊來復制病毒。一般在每個肝細胞核內(nèi)，可以有 5～50 拷貝的 cccDNA。2.2cccDNA 的意義：cccDNA在肝細胞內(nèi)很穩(wěn)定，只要肝細胞不被破壞很少釋放到外周血液循環(huán)，因此很難從血液中檢測。但如有大片肝細胞壞死，大量的 cccDNA 就會從細胞核內(nèi)釋放到血液循環(huán)，此時人體的免疫系統(tǒng)除對釋放的 cccDNA 有應答外，對于人的細胞核也會產(chǎn)生抗體，即抗核抗體。抗核抗體的存在是細胞核暴露所引起的。目前通過肝活檢來監(jiān)測乙肝患者肝組織中的cccDNA水平變化存在著一定困難，因而監(jiān)測血液中的cccDNA的動態(tài)變化也許更具有現(xiàn)實意義。當然，其中還存在一些問題有待研究和解決，比如血液中的cccDNA水平遠遠低于肝組織中的cccDNA水平，也遠遠低于血液中的的rcDNA水平，因此必須進一步提高cccDNA定量檢測的靈敏度。
3 針對 cccDNA 的治療現(xiàn)狀
目前臨床治療時雖然很多抗病毒藥物，但并沒有能夠進到細胞核以內(nèi)的藥物，還不能夠達到清除細胞核內(nèi) cccDNA 的目的。現(xiàn)有的抗病毒治療只是抑制病毒的復制，而不能把藏匿于核內(nèi)的，復制的最基本模板―― cccDNA 去掉。因此肝病往往是慢性的，而且比較容易復發(fā)，所謂復發(fā)，就是在肝細胞核內(nèi)“睡眠”的病毒 DNA 按照病毒自身的復制周期進行復制。 對于肝細胞以外的器官是否有 cccDNA 的存在，目前還在研究階段。另外，目前還沒有一個比較穩(wěn)定、可靠和敏感的 cccDNA 檢測的方法上市，因此 cccDNA 的檢測和治療都是相當困難的。
4 cccDNA 和 rcDNA 的差異
4.1一級結(jié)構(gòu)差異：從核酸的一級結(jié)構(gòu)來看 cccDNA 是一條完整的雙鏈，是共價閉和環(huán)。松弛環(huán)狀 DNA（ rcDNA ），雖然也是環(huán)狀的，但是它是有缺口的，它不完整的。4.2空間結(jié)構(gòu)差異：從核酸空間結(jié)構(gòu)來看cccDNA 是超螺旋結(jié)構(gòu)；rcDNA 是松弛環(huán)狀，不是超螺旋的結(jié)構(gòu)。4.3與蛋白結(jié)合差異：cccDNA 因為已經(jīng)形成了穩(wěn)定的共價閉合環(huán)狀的結(jié)構(gòu)，所以不能和蛋白結(jié)合。而 rcDNA 卻可以和蛋白共價結(jié)合，因此如果通過沉淀蛋白的方法來提取乙肝病毒的DNA ，所得到的更多的是cccDNA ，因為rcDNA 可以和蛋白結(jié)合被沉淀下去。4.3核酸酶抗性差異：cccDNA 對某些核酸酶的抗性較強，一般不易被降解，而 rcDNA 則相對較弱，很容易被降解。
關(guān)鍵詞： 5型腺病毒；間充質(zhì)干細胞（MSCs）；胰腺十二指腸同源框蛋白1（PDX1）；成對盒基因4（PAX4）；轉(zhuǎn)錄因子
中圖分類號：Q78文獻標志碼：A
文章編號：1672-1098（2016）02-0080-07
Abstract：With the use of pADxsi system， the recombinant adenovirus of expressing PDX1 and PAX4 is in place.GFP in the pShuttle-GFP-CMV vector is replaced with the target gene of PDX1 obtained from the pEGFP-N1-PDX1 plasmid， resulting in the pShuttleCMV-PDX1 plasmid. With the pEGFP-N1-PAX4 plasmid cut off， PAX4 is inserted into pShuttle-CMV-PDX1 to acquire the pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4 plasmid. Afterwards， the CMV-PDX1/CMV-PAX4 fragment is transferred to the ADxsi skeleton vector to get the pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4 virus vector. Finally， the recombinant adenovirus is packaged， amplificated， and titrated in HEK293 cells for the infection of human umbilical cord mesenchymal stem cells. The structure of pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4 adenovirus expression vector is confirmed by means of a restriction analysis and PCR. RT-PCR and Western blot results have established that the target genes are persistently expressed in the infected cells.The recombinant human PDX1 and PAX4 expressing adenovirus is successfully constructed， packaged， and amplificated.The target genes can be continuously presented in mesenchymal stem cells.
Key words：adenovims vector；pancreatic and duodenal homeobox factor 1；paired box gene 4；mesenchymal stem cells
糖尿病是由于胰島β細胞功能絕對或相對缺陷，以慢性高血糖為特征的終身性代謝性疾病[1-2]。長期血糖增高，可導致大血管、微血管受損并危及心、腦、腎、周圍神經(jīng)、眼睛、足等，每年因糖尿病死亡者有一半以上是心腦血管所致，10%是腎病變所致；因糖尿病截肢是非糖尿病的10～20倍[3-4]。因此，預防糖尿病的并發(fā)癥并最終控制血糖是重要的社會問題。
至目前為止，控制患者血糖仍主要是依賴每天胰島素的補充，給患者生活帶來極大的不便與沉重的經(jīng)濟負擔。尋找具有合成與分泌胰島素的細胞進行細胞替代治療一直是研究的熱點。近年來研究證實間充質(zhì)干細胞具有多向分化的潛能且無免疫原性，是一類極具應用潛能的干細胞[4-5]。胰十二指腸同源框基因1 （pancreatic and duodenal homeobox factor 1，PDX 1）在胚胎發(fā)育過程中具有促進胚胎干細胞向胰腺的早期發(fā)育和晚期胰島素分泌細胞分化的功能[6]；此外，還具有維持胰島β細胞合成與分泌胰島素的功能[7-8]；然而，單獨的PDX1轉(zhuǎn)錄因子并不能有效誘導干細胞定向向胰島β細胞分化，在胰腺前體分化與發(fā)育過程中，成對盒基因4（paired box gene 4，PAX4）表達將有利于胰腺前體細胞定向向β細胞分化，并參與調(diào)控β細胞功能的成熟[8-10]。因此，PDX1與PAX4聯(lián)合作用對誘導MSCs定向向具有合成與分泌胰島素功能的β樣細胞可能具有促進作用，基于這一假設(shè)，在本研究中，選用對MSCs具有較高感染效率的Ⅴ型腺病毒載體，構(gòu)建攜帶目的基因PDX1與PAX4的重組腺病毒ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4，感染MSCs細胞，以觀測所攜帶的目的基因表達情況，為進一步研究PDX1與PAX4在誘導MSCs向具有合成與分泌胰島素功能的β樣細胞分化的可能及其分子機制奠定實驗基礎(chǔ)。
1材料和方法
1.1材料與試劑
Bgl II等多種限制性內(nèi)切酶、Klenow及T4 DNAligase均購自美國Sigma 公司；CIP（Alkaline Phosphatase，Calf Intestinal）酶、質(zhì)粒提取純化試劑盒和凝膠回收試劑盒購自北京天恩澤公司；腺病毒pADxsi載體系統(tǒng)由上海漢恒生物有限公司提供；293細胞及DH5a菌株由深圳清華研究院鄭義博士惠贈，pEGFP-N1-PAX4與pEGFP-N1-PDX1質(zhì)粒為前期本實驗室所構(gòu)建。Anti-PAX4 antibody （ab42450）/IgG、Anti-PDX1 antibody （ab47383）/IgG購自美國Abcam公司，HRP標羊抗鼠IgG、HRP標羊抗兔IgG、FITC標羊抗兔IgG、CY5標羊抗鼠IgG購自eBioscience公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；RT-PCR試劑盒為北京天恩澤公司； DMEM/F12培養(yǎng)基購自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Hyclone公司。原代人臍帶間充質(zhì)干細胞購自北京醫(yī)科利昊生物科技有限公司。
1.2方法
1） pADxsi-CMV- PDX1/CMV- PAX4腺病毒載體的構(gòu)建。 首先構(gòu)建pShuttle-GFP-CMV- PDX1穿梭質(zhì)粒：已知PDX1序列上游有Nhe I和Bgl II酶切位點，下游有Sal I和EcoR I酶切位點，首先用Sal I酶切pEGFP-N1- PDX1，再用Klenow平端處理，最后用Nhe I酶切，回收0.66 kb片段；其次用Nhe I和Pme I雙酶切pShuttle-GFP-CMV載體，替換GFP， CIP去磷酸化處理，回收載體片段5.2 kb；最后，酶連切好的載體片段和插入片段，獲得pShuttle-CMV-PDX1。再構(gòu)建pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4穿梭質(zhì)粒載體：從pEGFP-N1-PAX4上用BamH I和Sal I雙酶切切下PAX4（PAX4序列上游存在BamH I和Bgl II酶切位點，下游存在Xba I和Sal I酶切位點）；同時對pShuttle-CMV- PDX1載體用BamH I和 Sal I雙酶切，CIP去磷酸化處理，膠分別回收與純化載體與酶切PAX4目的基因片段并用T4 DNA 連接酶酶連得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4穿梭質(zhì)粒。最后用T4 DNA 連接酶酶連目的片段pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4和pADxsi骨架質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化產(chǎn)物并轉(zhuǎn)染DHSa，擴增pADxsi -CMV-PDX1/CMV- PAX4質(zhì)粒，對質(zhì)粒產(chǎn)物進行提取并進行電泳簽定，產(chǎn)物由上海豐恒生物科技有限公司進行測序鑒定。
2） 重組腺病毒的包裝、擴增和滴度測定。 Pac I酶切線性化重組腺病毒質(zhì)粒，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細胞密度約80%的293細胞。3～5 d后，開始出現(xiàn)明顯噬斑，待大部分細胞病變（cyto-pathic effect，CPE）時，收集細胞混懸液，于-80℃/25℃反復凍融3次，再離心收集上清，繼續(xù)感染293細胞擴增病毒以提高腺病毒（ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4）滴度，TCID 50法測定病毒滴度。
3） ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4感染MSCs與目的基因表達。 于六孔板接種MSCs細胞5.0×105/孔，細胞密度達80%時，按感染指數(shù)為10PFU/細胞、50PFU/細胞、100PFU/細胞加入相應量的腺病毒液；同時設(shè)ADxsi-CMV-GFP感染的空病毒對照組。當實驗進行到相應階段時，即培養(yǎng)到24h、48h和72h等階段分別收集細胞行WB、免疫細胞化學與間接熒光檢測；同時RT-PCR檢測目的基因表達，引物分別如下PDX1 的F：5′-AAGCTAGCCCGCAGCCATGA-3′、R：5′-TCCTCGAGTCATCGTGGTTCCTG-3′，Tm為61.5℃，擴增目的片段為882bp；PAX4：F：5′-TCCCAGTGTCTCCTCCATC-3′、R：5′-ACCTTTCCGGTGCTGTTGC-3′，Tm為60 ℃，擴增目的片段為515 bp；內(nèi)參照分子GAPDH：F：5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′、R： 5′-TGAGGAGGGGAGATTCAGTG-3′。
（4）Western blotting檢測
胰酶消化，收集目的細胞，裂解細胞并離心取上清液，應用15%的SDS-PAGE膠電泳2h后，濕轉(zhuǎn)移法至PVDF膜，脫脂牛奶TBST液封閉1h，再分別加抗人PAX4、PDX1抗體IgG液振蕩過夜，HRP標記相應二抗親合反應后ECL顯色。
2結(jié)果
2.1鑒定重組腺病毒質(zhì)粒
Xho I酶切pADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4病毒質(zhì)粒，陽性克隆pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4由以下6條帶組成即：14 kb、11.8 kb、5.9 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb；而陰性克隆（pADxsi骨架質(zhì)粒）只有以下6條帶組成：14 kb、11.8 kb、4.0 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb；酶切結(jié)果陽性質(zhì)粒均與理論預期一致，具體酶切結(jié)果（見圖1）。
2.2重組腺病毒的包裝和滴度測定
Pac I酶切線性化的pADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染293細胞后3 d，開始出現(xiàn)病變效應（見圖3）。120 h后，此時約70%細胞懸浮，收集細胞與上清液體，凍融后，再應用293細胞重復擴增、收集病毒液。空斑計數(shù)法（PFU）測定病毒滴度為1.0×108 PFU/mL；使用同樣方法測定對照組。空載腺病毒ADxsi的滴度為2.0×108 PFU/mL。
2.3 目的基因表達
MSCs在光學顯微鏡下呈典型的長梭形，呈漩渦狀或放射狀平行排列（見圖4）； ADxsi-CMV-GFP空病毒感染后24 h即可在熒光鏡下觀察到GFP表達。免疫細胞化學染色與間接熒光分別證實ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒以感染復數(shù)（MOI）=100感染目的細胞 （MSCs）24 h后，實驗組MSCs的細胞核中即可檢測到PDX1與PAX4 mRNA；細胞化學檢測顯示，PDX1與PAX4 主要定位于細胞核內(nèi)，陽性率高于75%。間接熒光同樣證實細胞核中PAX4（FITC）與PDX1 （CY5）均穩(wěn)定表達（見圖4）。
轉(zhuǎn)染后光鏡下的細胞形態(tài)相同于正常的MSCs細胞形態(tài)，呈梭形排列，應用ADxsi-CMV-EGFP空病毒感染細胞后，可見到細胞內(nèi)綠色熒光表達，分別應用抗體檢測PDX1與PAX4表達與定位，熒光結(jié)果顯示PDX1與PAX4均定位于細胞核內(nèi)，且免疫細胞化學檢測也證實兩轉(zhuǎn)錄因子定位于細胞核內(nèi)，且穩(wěn)定表達。
2.4 目的基因轉(zhuǎn)錄與表達
RT-PCR法與WB分別檢測重組腺病毒ADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4轉(zhuǎn)染后不同時段細胞內(nèi)目的基因mRNA和蛋白表達結(jié)果顯示：MSCs胞質(zhì)內(nèi)PDX1與PAX4 mRNA水平穩(wěn)定；進一步Western blotting（WB）法檢測感染后12 d的細胞核內(nèi)PDX1與PAX4蛋白一直穩(wěn)定表達（見圖5），提示重組腺病毒ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4可以有效感染MSCs，且目的基因均能穩(wěn)定表達，這為后續(xù)研究目的基因在MSCs轉(zhuǎn)分化過程中的功能奠定實驗基礎(chǔ)。
3討論
MSCs具有多向分化潛能，為探討MSCs分化為合成與分泌胰島素功能的胰腺β細胞，選用了在胰腺前體細胞向β細胞分化過程中起關(guān)鍵作用的兩個轉(zhuǎn)錄因子PDX1與PAX4[8-11]，并構(gòu)建對MSCs具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染能力的Ⅴ型腺病毒載體[12-13]，用PDX1換去示蹤基因EGFP，把PAX4基因插入到多克隆位點，構(gòu)建并包裝成帶PDX1與PAX4雙目的基因的活性重組腺病毒（ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4），酶切結(jié)果與測序結(jié)果證實重組腺病毒構(gòu)建成功，目的基因連接正確。
應用ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4感染MSCs結(jié)果顯示，重組病毒可以穩(wěn)定高效感染MSCs，間接熒光檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染的MSCs在細胞核穩(wěn)定表達PDX1與PAX4分子，細胞化學染色結(jié)果同樣證實PDX1與PAX4分子定位于在MSCs細胞核內(nèi)，這提示帶PDX1與PAX4轉(zhuǎn)錄因子基因的重組腺病毒不僅可以高效感染目的細胞，并且穩(wěn)定表達目的轉(zhuǎn)錄因子，而且所帶的轉(zhuǎn)錄因子均具有核定位功能。
另一方面應用RT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)錄重組腺病毒的MSCs細胞內(nèi)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平表明目的基因在重組腺病毒感染細胞后仍可以檢測到轉(zhuǎn)錄目的基因的mRNA水平穩(wěn)定，提示在腺病毒的CMV啟動子的作用下，目的基因在細胞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄。進一步抽提感染腺病毒的MSCs的細胞白，并行WB檢測PDX1和PAX4轉(zhuǎn)錄因子蛋白水平，發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)錄因子在細胞核水平穩(wěn)定，這一方面提示腺病毒的CMV啟動子具有強的啟動目的基因轉(zhuǎn)錄功能，另一方面，目的轉(zhuǎn)錄因子穩(wěn)定定位于細胞核，說明表達的轉(zhuǎn)錄因子具有核定位能力。的并且能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄與表達PDX1與PAX4分子。
綜上檢測結(jié)果證實， PDX1與PAX4雙帶目的基因的Ⅴ型重組腺病毒被成功構(gòu)建，重組腺病毒所帶的目的基因均能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄與翻譯成功能轉(zhuǎn)錄因子PDX1與PAX4，且兩功能轉(zhuǎn)錄因子均具有核定位功能，這為下一步研究2功能轉(zhuǎn)錄因子在誘導MSCs定向向胰腺β細胞分化過程中的功能與分子機制奠定了實驗基礎(chǔ)。
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初見馬炯，并沒有想象中那么嚴肅。他坦誠、開朗、愛笑，直言不諱，又分寸有佳。他聊星座，說自己能在兩個領(lǐng)域里吃香大概是“托了這個雙子座的福”；還笑言自己是追星族，并拿出與諾獎得主的照片和記者一同分享。而談及他的科研工作，馬炯并沒有太多地說起科研工作的辛苦，而是更多地分享他的步步歷程。
一半是技術(shù)，一半是生物
馬炯1999年進入復旦大學物理系，2008年取得物理系光學專業(yè)博士學位。博士階段開始，馬炯就致力于發(fā)展光學技術(shù)與生物課題相結(jié)合的研究工作。期間他曾作為訪問學者前往南非羅德斯大學化學系和挪威奧斯陸大學生理系進行學術(shù)交流。
在南非期間，他確認水溶性CdTe量子點的光催滅機理，首次測定其單態(tài)氧產(chǎn)量，并開創(chuàng)出一種應用于其實現(xiàn)光動力治療癌癥的方法。2008年赴美從事博士后工作后，他一直致力于發(fā)展新型的單分子超分辨熒光顯微鏡，用于細胞核孔復合物的研究工作。在美國，馬炯與Yang教授共同開發(fā)了SPEED顯微技術(shù)，并在10nm空間精度和400μs時間精度下，研究了各類分子穿越細胞核孔的選擇機制。他首次觀測到細胞核孔內(nèi)非折疊蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并首次獲得生物小分子穿越細胞核孔三維路徑，確定了其間的選擇性機制，并于2010年及2012年在Proceedings of the National Academy of Sciences上發(fā)表了兩篇高質(zhì)量論文。
馬炯還與Walter教授合作，開發(fā)應用于超分辨顯微鏡的mRNA熒光標記系統(tǒng)，結(jié)合單分子顯微追蹤技術(shù)，完成了mRNA穿越核孔的選擇機制的初步研究，確認了mRNA核孔輸出三維路徑，糾正了一維路徑數(shù)據(jù)所造成的認知誤解，并發(fā)表在Nature Communication上。
而談到技術(shù)和生物研究，馬炯說他從來沒有糾結(jié)兩者之間的取舍，而是始終游走在兩者的平衡之中。曾經(jīng)在南非和挪威做訪問學者的時候，他感到技術(shù)上偏重太多時，就在前去美國的時候有意識地加重了生物研究的選擇。技術(shù)是他的“技”，而生物就是他的“巧”。有技方成巧，通過超分辨率光學顯微鏡的技術(shù)不斷提高，他在細胞核孔復合物領(lǐng)域的研究也不斷加深；以巧推動技，通過細胞核孔復合物實驗研究的需求，他又不斷革新超分辨光學顯微鏡的技術(shù)。雙子的多面性，他展現(xiàn)在了科研領(lǐng)域中，并且大獲成功。
2015年6月，馬炯歸國。他坦言，歸國的一部分原因是因為故鄉(xiāng)的父母，另一部分則是國家現(xiàn)在對于青年學者的重視，能夠讓他在最有精力的時刻投入到科研中去。“能夠為國家做一點事情，國家也重視我做的事情，這當然是再好不過了。”馬炯笑言。
超分辨光學顯微鏡下看世界
顯微鏡的發(fā)展?jié)M足了人們對觀察微觀世界的需求，讓人們可以看得越來越“小”。但由于衍射極限的存在，幾十年來光學顯微鏡的分辨率停滯在了200nm左右。2014年諾貝爾化學獎頒發(fā)給了美國及德國三位科學家Eric Betzig、Stefan W. Hell和William E. Moerner，獲獎理由是“研制出超分辨率熒光顯微鏡”。幾位獲獎者巧妙設(shè)計了避開衍射極限的方法，其研究突破性地將光學顯微鏡帶入了納米維度。在納米顯微鏡下，科學家實現(xiàn)了活體細胞中單個分子通路的可視化，能夠觀察到分子是如何在大腦神經(jīng)細胞之間生成神經(jīng)突觸；可以追蹤帕金森病、阿爾茲海默癥和亨廷頓癥患者體內(nèi)相關(guān)蛋白的累積情況；還能跟蹤受精卵在分裂形成胚胎時蛋白質(zhì)的變化過程。現(xiàn)在已經(jīng)進入了“光學顯微鏡2.0”的時代，超分辨熒光顯微鏡推動著新一輪生物醫(yī)學的飛速發(fā)展。
現(xiàn)今，已具有多種不同超分辨成像技術(shù)實際應用于生物系統(tǒng)的范例，也已出現(xiàn)了商業(yè)化的超分辨顯微鏡系統(tǒng)，但仍然沒有達到完美狀態(tài)。在許多生物研究中，各類超分辨系統(tǒng)有著各自的局限性，如對于特殊熒光標記的發(fā)光特性依賴，或是高空間精度測量制約了探測時間進一步縮短。因此，研究和發(fā)展合適新的原理和方法，研制出適合專項生物課題研究的顯微鏡將是今后發(fā)展的一大方向。
談起二維到三維的超分辨退卷積計算開發(fā)的時候，馬炯說起了一個有意思的故事：他做出這個開發(fā)之后，花了整整一個星期的時間說服他的老師來相信他的成果，因為他的老師根本無法想象有人可以做出從二維分布中獲取系統(tǒng)的三維分布的開發(fā)。而當他的老師認可了他的成果，他和他的老師又開始一起說服領(lǐng)域里的其他研究者一起應用這項成果的相關(guān)研究人員。“這告訴我們，固化思維的可怕。科技要進步，科研人員要創(chuàng)新研究，首先就要從打破自己的固有傳統(tǒng)認知開始。”馬炯嚴肅地說。
歸國后的馬炯將開始著手建立顯微鏡第二平臺熒光返還探測技術(shù)，實現(xiàn)兼具超高的時間和空間分辨率的三維分子熒光追蹤系統(tǒng)。他將把研究中所獲得的信息將與跟蹤RNA輸出細胞核孔的研究互相印證，通過分析RNA在細胞核孔各位置的高時空精度動態(tài)過程，進一步研究細胞核孔蛋白調(diào)控基因的機理。此外，研究中所發(fā)展的原理和方法還將能夠被廣泛用于毫秒量級甚至更快的纖毛內(nèi)分子運輸、細胞間分子交換及跨膜通道開關(guān)等生物問題的研究。
在研究中，馬炯將采用創(chuàng)新技術(shù)，促使實驗系統(tǒng)同時具有很高的時間和三維空間分辨率，在不影響平面二維光學分辨精度的前提下，不通過擬合點擴散函數(shù)，而在亞毫秒級時間分辨量級和10nm三維空間分辨量級，實現(xiàn)對三維單分子熒光信息的實時探測和分析，滿足高速動態(tài)生物學研究的特點和條件。在新型光學系統(tǒng)中，他還將利用凹面鏡返還光程無色差的光學原理，創(chuàng)新設(shè)計凹面鏡熒光返還光路系統(tǒng)，能夠?qū)方向信息轉(zhuǎn)換成x-y水平方向的信息，從而獲取單分子z方向的位置信息。
細胞核孔復合物探尋
在細胞核孔復合物的研究中，馬炯將利用SPEED顯微鏡技術(shù)，完成各類FG屏障與各類主要的傳輸分子間反應區(qū)域的三維分布測量。細胞核孔復合物是真核細胞中連接細胞質(zhì)和細胞核之間的選擇性雙向通道，控制著絕大部分細胞核所需的蛋白輸入，以及核內(nèi)基因物質(zhì)的輸出。可以說，核孔是細胞內(nèi)基因調(diào)控中非常重要的一個環(huán)節(jié)。核孔的缺陷會導致核孔相關(guān)的白血病及阿爾茲海默癥等疾病。其本身更是各類病毒侵入細胞的重要關(guān)口之一，各類病毒會通過不同的方式通過核孔，最終侵入細胞的基因表達系統(tǒng)導致疾病發(fā)生。核孔的結(jié)構(gòu)與功能的研究將為各類基因調(diào)控機制的研究提供一環(huán)重要的依據(jù)，對核孔蛋白缺失相關(guān)的白血病、阿爾茲海默癥的致病機制，以及各種類病毒的侵入機制等核孔相關(guān)病理機制或基因治療提供關(guān)鍵信息。
一個NPC是由30種多不同的核孔蛋白構(gòu)成，長約200nm、直徑為120nm、中心內(nèi)徑為50nm的大分子復合物。其中有三分之一的核孔蛋白富含苯丙氨酸-甘氨酸（FG）氨基酸片段，且在自然狀態(tài)下呈現(xiàn)出非固定形態(tài)，我們稱之為FG-Nups。這些FG-Nups組成了具有選擇性機制的FG屏障。FG屏障選擇性地調(diào)控基因相關(guān)物質(zhì)按照被動運輸或者主動介入運輸?shù)姆绞竭M出細胞核：只有小于60kDa的分子才能通過被動運輸?shù)姆绞剑杂蓴U散通過NPC；另一種方式是主動運輸，如含有入核信號或者核孔輸出信號的蛋白或復合物分子，在核孔運輸?shù)鞍讕椭拢纬蓮秃衔铮ㄟ^TRs與FG片段相互作用，從而通過FG屏障。TRs與需要傳輸?shù)牡鞍仔纬傻膹秃衔锏慕Y(jié)合與解離，通過細胞核內(nèi)外的RanGDP和RanGTP的濃度梯度來調(diào)節(jié)。通過電子顯微鏡可以觀察到細胞核孔結(jié)構(gòu)蛋白，但卻無法獲得這些高度自由的非折疊蛋白的結(jié)構(gòu)，所以至今在生理狀態(tài)下FG屏障及其相關(guān)的核孔物質(zhì)傳輸?shù)臋C理仍不清楚。
馬炯將利用SPEED顯微鏡技術(shù)，完成各類FG屏障與各類主要的傳輸分子間反應區(qū)域的三維分布測量。他將確認活細胞內(nèi)FG-Nup相互反應的存在及相應的水凝膠分布。綜合各反應分布，完成接近完善的FG屏障的完整分布。他還將利用基因敲除，獲取缺失核孔蛋白的分布，理解其對白血病的致病機理及對腺相關(guān)病毒（AAV）基因療法的調(diào)控機制。從傳輸?shù)鞍组g的競爭情況，了解細胞核孔在大通量物質(zhì)運輸下對應的優(yōu)先選擇機制。
達成這項研究的基礎(chǔ)，是SPEED顯微技術(shù)能在超短的時間內(nèi)獲得高精度的空間位置信息，調(diào)控光學設(shè)置的穩(wěn)定和準確，以及對各不同分子不同擴散速率下，在確保單分子熒光定位精度的同時，優(yōu)化實驗條件獲取最多的數(shù)據(jù)量，是實驗成功的關(guān)鍵。擁有豐富的超分辨光學經(jīng)驗，這讓馬炯能夠滿足數(shù)據(jù)的準確性及穩(wěn)定地產(chǎn)出量。據(jù)此，他將創(chuàng)新領(lǐng)先技術(shù)，努力實現(xiàn)分子競爭通過核孔的實驗設(shè)計創(chuàng)新。
未來故事
回國后的馬炯選擇了他的母校復旦大學作為科研工作的新起點。這里熟悉的環(huán)境讓他很快就進入到了工作當中并規(guī)劃新的征程。
首先，馬炯將繼續(xù)提升SPEED顯微技術(shù)的性能及推廣其應用范圍。所有的對稱體系研究中，馬炯的SPEED顯微技術(shù)都可以推廣應用。而在快速跟蹤領(lǐng)域中，這項技術(shù)也具有明顯優(yōu)勢。其次，他將繼續(xù)完善超快速的實時單分子三維追蹤。再次，馬炯將提高靜態(tài)單分子熒光定位下的超分辨圖像精度。現(xiàn)在的主流超分辨顯微鏡是用了一種光開關(guān)蛋白來實現(xiàn)，這將會造成單位時間內(nèi)的信號光的損失。馬炯換了其他方式，利用分子運動進特定區(qū)域時將這個分子可能發(fā)出的所有熒光進行收集，從而提高靜態(tài)單分子熒光定位下的超分辨圖像精度。
此外，馬炯還將利用單分子熒光圖像獲取除未知外的其他信息。他認為這部分是相當有意思的內(nèi)容。利用這些單分子圖像可以看到，隨著探測時間的加長，隨著分子運動速度越來越快，這個分子的單分子影像所占區(qū)域會越來越大，馬炯可以通過這些分子的大小探測到運動速率的快慢，確定這個區(qū)域的黏滯性有多大，從而找到這個分子所在納米位置的環(huán)境信息。
【摘要】 目的 探討冬眠心肌細胞內(nèi)TNF-α mRNA與心肌細胞凋亡的變化和意義，初步探索冬眠心肌形成的分子生物學機制。方法 行冠狀動脈搭橋手術(shù)（CABG）的冠心病患者10例，術(shù)前1周內(nèi)用多巴酚丁胺超聲負荷試驗（DSE）結(jié)合多普勒組織成像(DTI)確定冬眠心肌及正常心肌的存在部位，CABG術(shù)中根據(jù)檢測結(jié)果進行取材（分別取正常心肌和冬眠心肌），并經(jīng)電鏡證實。取材心肌用 Tunel法檢測心肌細胞凋亡情況，原位雜交法(ISH)測定TNF-α mRNA的活性。分析TNF-α mRNA與心肌細胞凋亡的關(guān)系。結(jié)果 冬眠心肌細胞凋亡數(shù)及TNF-α mRNA的表達較正常細胞高；TNF-α mRNA與冬眠心肌細胞凋亡數(shù)相關(guān)（r＝0.816，P＜0.05）。結(jié)論 心肌缺血缺氧時，心肌細胞內(nèi)TNF-α分泌增加，TNF-α促進冬眠心肌的形成并誘導心肌細胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】 冬眠心肌；腫瘤壞死因子α；分子生物學機制
心肌冬眠(hibernating myocardium，HM)是心臟自動適應心肌慢性低灌注的一種反應，此時心肌灌注和心肌功能之間達到一種新的平衡。HM已成為近年來冠心病研究領(lǐng)域的熱點之一，但迄今HM形成的確切機制尚不完全清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，HM局部收縮功能與腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)高表達呈負相關(guān)［1］，TNF-а的高表達可以促進動物心肌細胞凋亡。TNF-α的表達與冠心病患者HM凋亡之間的關(guān)系鮮見報道。本研究觀察冠心病患者HM細胞的TNF-α mRNA表達，同時觀察HM細胞凋亡情況。
1 材料和方法
1.1 實驗材料 TNF-α mRNA原位雜交試劑盒、細胞凋亡試劑盒均購自武漢博士德生物公司。冠心病患者的心肌標本由徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸心外科協(xié)助取材。
1.2 心肌標本來源 10例心肌標本均來自2004年8月—2006年3月在我院胸心外科行冠狀動脈搭橋手術(shù)（CABG）的冠心病患者，冠狀動脈造影至少有1支冠狀動脈狹窄程度大于85%。男性7例，女性3例，平均年齡（58.3±4.24）歲。術(shù)中取HM及正常心肌（normal myocardium，NM）。
1.3 HM定位
1.3.1 采用多巴酚丁胺超聲負荷試驗(DSE)結(jié)合組織多普勒成像（DTI）技術(shù)。將左心室按美國超聲心動圖協(xié)會方法分為相對應的16個節(jié)段。
1.3.2 DSE檢查方案 試驗分為靜息、多巴酚丁胺10 μg/(kg·min)、30 μg/(kg·min) 3個級別，每級負荷維持5 min，于每級負荷時記錄超聲圖像，并記錄常規(guī)12導聯(lián)ECG和血壓；終止指標為：出現(xiàn)心絞痛；收縮壓
1.3.3 室壁節(jié)段運動異常的判定 DTI測量心肌收縮期峰值平均運動速度。如靜息時平均運動速度低于正常速度，負荷10 μg/(kg·min) 多巴酚丁胺時心肌運動速度較靜息時明顯增高，負荷30 μg/(kg·min) 多巴酚丁胺時心肌運動速度反而減低，此時定義心肌運動呈雙相反應，判定為HM。
1.4 心肌處理 4%戊二醛、10%甲醛（含0.1%焦碳酸二乙酯，DEPC）固定，在電子顯微鏡觀察確認后分別進行ISH、Tunel試驗。ISH法測TNF-α mRNA，Tunel法檢測細胞凋亡。原位雜交及Tunel法均按試劑說明書進行操作。
原位雜交探針序列為：
（1）5′-GAGCA CTGAA AGCAT GATCC GGGAC GTGGA-3′
（2）5′-GAGTG ACAAG CCTGT AGCCC ATGTT GTAGC-3′
（3）5′-GGGCA GGTCT ACTTT GGGAT CATTG CCCTG-3′
1.5 統(tǒng)計學處理 計量數(shù)據(jù)以±s表示，統(tǒng)計軟件采用SPSS 13.0，統(tǒng)計方法采用配對t檢驗。檢驗水準α＝0.05。
2 結(jié) 果
2.1 病理結(jié)果 電鏡下(×12 000)可見HM與NM比較有以下一些特點：心肌纖維數(shù)量減少、稀疏，心肌纖維數(shù)量減少主要集中在細胞核周圍。心肌纖維數(shù)量減少時細胞容量無變化（這一點與細胞萎縮不同）；心肌細胞內(nèi)出現(xiàn)糖原積淀；心肌細胞內(nèi)線粒體體積變小，散在分布于胞質(zhì)內(nèi)；細胞核扭曲，可見散在的異染色質(zhì)；心肌細胞內(nèi)沒有發(fā)生小泡、水腫、染色體腫脹、細胞核崩解、脂質(zhì)沉積等細胞壞死和萎縮時常見的變化。見圖1A。
2.2 原位雜交結(jié)果 HM TNF-α mRNA胞質(zhì)著色成棕黃色（圖1B），原位雜交用Leica Qwin圖像分析儀測定平均灰度值。HM組TNF-α胞質(zhì)平均灰度值明顯高于NM組(P＜0.05)。見表1。
2.3 心肌凋亡細胞計數(shù) NM細胞核呈藍色，而HM中凋亡心肌細胞核呈棕黃色（圖1C）。在光學顯微鏡下計數(shù)5個高倍視野（HPF，×100）中凋亡陽性心肌細胞核數(shù)目求其均值，HM組陽性心肌細胞凋亡數(shù)明顯高于NM組。見表1。
2.4 HM 組TNF-α mRNA表達水平與心肌細胞凋亡數(shù)的相關(guān)性 HM 組TNF-α mRNA胞質(zhì)平均灰度值與心肌細胞凋亡數(shù)成正相關(guān)（r=0.816，P＜0.05）。 表1 2組TNF-α mRNA測定的灰度值及心肌細胞陽性凋亡數(shù)的比較
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3 討 論
TNF-α是一種具有多種生物學效應的細胞因子，人體包括心肌細胞在內(nèi)的大部分細胞都能夠合成TNF-α［3］，其參與介導多種疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理過程。TNF-α主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生，血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞也可合成釋放。心肌也可分泌TNF-α，而且心肌細胞膜存在TNF-α受體。因此，心肌既是TNF-α的分泌場所，也是其作用的靶目標［4］。在生理狀態(tài)下，TNF-α具有調(diào)節(jié)免疫應答、促進細胞生長分化、參與機體免疫反應等多種生物活性；在病理狀態(tài)下則引起炎癥反應、器官損害，使心肌細胞收縮力下降、心肌肥大及心肌細胞纖維化，最終導致心功能不全［5］。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在心肌梗死患者心肌細胞凋亡中發(fā)揮介導作用［8］。Krown等［9］研究表明，TNF-α可使培養(yǎng)鼠的心肌細胞發(fā)生凋亡，且凋亡細胞數(shù)量與TNF-α濃度成正比。劉亮等［10］研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷和持續(xù)缺血可導致心肌細胞凋亡，抗TNF-α單克隆抗體預處理能明顯減輕心肌細胞凋亡程度。本研究用DSE結(jié)合DTI的方法定位冠心病患者HM的部位成功取材，經(jīng)電鏡觀察證實HM中TNF-α mRNA表達及心肌細胞凋亡數(shù)較正常心肌明顯升高。TNF-α mRNA表達與與HM凋亡數(shù)目成正相關(guān)。表明心肌缺血缺氧時，心肌細胞內(nèi)TNF-α分泌增加。TNF-α促進HM的形成，并可介導細胞凋亡。HM內(nèi)凋亡細胞會影響心肌功能，而大量存在的凋亡細胞會使血運重建后的HM功能恢復受限。本研究表明，通過觀察心肌TNF-α mRNA的表達，能間接反映冠心病患者HM細胞凋亡的水平，為臨床是否進行血運重建治療提供依據(jù)。
本研究的不足之處是：采用DSE結(jié)合DTI檢測HM的方法尚達不到HM檢測的“金標準”，但經(jīng)過電鏡證實也能達到準確診斷的要求。 另外就是所收集的病例數(shù)有限。TNF-α對敏感細胞的凋亡效應是通過與細胞膜上特異性TNF受體（TNFR，主要是TNFR1）結(jié)合后，觸發(fā)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉(zhuǎn)導介導細胞凋亡。至于TNF-α表達促進MAPK活化介導細胞凋亡的具體過程目前尚不十分清楚，仍需進一步研究證實。
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